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鲍（Haliotis diversicolor supertexta）核转录因子Ab-Rel的功能与特性分析及分子检测方法的建立

作　者: 姜玉声
导　师: 吴信忠
学　校: 浙江大学
专　业: 海洋生物病害学
关键词: NF-κB 腹足动物九孔鲍免疫分子进化基因表达分子结构亚细胞定位双抗体ELISA 磁捕获
分类号: S917.4
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

Rel／NF-κB是一族重要的转录因子蛋白，其参与调控免疫细胞活化、胚胎发育、应激反应、细胞增殖和凋亡等多种细胞生理活动。研究表明NF-κB过度活化与炎症、肿瘤、病毒感染等免疫及病理过程有非常密切的关系。在高等哺乳动物，Rel／NF-κB作为免疫信号传导因子得到了较深入的研究。新药研发领域中，NF-κB信号通路也已成为了重要的靶点。本论文包括基础理论研究和新应用技术研究两部分。在基础理论研究方面，最主要创新性成果是(Ⅰ)在国际上第一次克隆了腹足动物九孔鲍H. diversicolor supertexta核转录因子(Ab-Rel)基因，测定了该基因的全长cDNA核苷酸序列，确定了Ab-Rel与同源蛋白的分子进化关系；(Ⅱ)对Ab-Rel两个不同功能区进行了重组表达、蛋白纯化、功能分析与抗体制备，通过试验证明了Ab-Rel与Rel／NF-κB蛋白家族在功能上的相似性，确定了贝类NF-κB蛋白的分子结构模式；(Ⅲ)对Ab-Rel进行了转录表达、蛋白活性等功能分析，揭示了贝类NF-κB在免疫反应中的激活机理，用实验证明了NF-κB信号通路在贝类中的功能保守性；(Ⅳ)利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达了鲍核转录因子蛋白，对Ab-Rel在昆虫细胞中进行了亚细胞定位，并对其核定位信号进行了功能鉴定。所有试验结果为低等无脊椎动物天然免疫防御系统的研究以及探索NF-κB信号通路的进化起源提供了基础。在新应用技术研究方面，建立了(Ⅰ)双抗体间接ELISA和(Ⅱ)磁捕获等分离检测NF-κB蛋白的新技术。双抗体间接ELISA技术是利用两个分别针对Rel蛋白不同分子结构域的抗体，对体内NF-κB蛋白进行检测，该技术要比普通的ELISA灵敏，更适用于检测表达量较低，如转录因子之类的蛋白。我们建立的用于分离NF-κB蛋白的磁捕获技术是以磁珠-DNA-蛋白质亲和为基础的分离技术，因为只有具有活性的NF-κB才能被磁珠捕获，所以该技术不仅能用于分离NF-κB，同时还能对其活性进行检测。磁捕获NF-κB技术操作简单，样品受外力影响小，为研究蛋白互作以及药物筛选提供了一条新的途径。主要结果包括下列部分：1．鲍核转录因子全长cDNA的克隆与序列分析根据Rel蛋白的结构特征设计了寡聚核苷酸引物，利用3′，5′cDNA未端快速扩增技术(3′，5′RACE)获得了鲍核转录因子(Ab-Rel)的全长cDNA序列。该cDNA全长1943bp，具有一个1752 bp的开放读码框，编码大小为584个氨基酸的蛋白。对Ab-Rel核酸和氨基酸序列进行生物信息学分析，并构建了系统进化树。结果表明，鲍核转录因子Ab-Rel具有Rel蛋白家族的主要特征，如DNA结合基序RGLRFRYECE，核定位信号(nuclear localization signal，NLS)EEKRKR和位于NLS上游25个氨基酸的磷酸化位点RRPS。在以邻近法构建的系统进化树中，Ab-Rel与昆虫Dorsal类Rel蛋白分在同一个亚群中，并都归属于羧基端具有转录激活域(TD)的Rel蛋白家族。2．Ab-Rel的原核表达，蛋白活性分析与鲍NF-κB分子结构的鉴定根据Ab-Rel特殊的蛋白结构分别构建了九孔鲍Ab-Rel的Rel同源区(RHD)和转录激活区(TD)的原核表达载体，在大肠杆菌中进行高效表达和纯化，并制备了对Ab-Rel RHD和TD特异的两个多克隆抗体。EMSA结果表明重组Ab-Rel RHD蛋白具有特异的DNA结合能力，从蛋白功能上证实了Ab-Rel与其它Rel家族成员的相似性。以获得的两个抗体进行Western印迹分析了鲍NF-κB蛋白的分子结构，证实了Ab-Rel是鲍NF-κB蛋白的一个大亚基，进而从分子结构上验证了NF-κB蛋白在腹足动物-鲍与高等动物之间的相似性。3．Ab-Rel的表达分析通过半定量RT-PCR和Norther杂交试验检测不同组织中Ab-Rel mRNA的含量发现，Ab-Rel在所检测的组织中均有表达，表现了其功能的多样性。但在血淋巴细胞中Ab-Rel转录子的含量相对较多，表明Ab-Rel在鲍免疫反应中发挥积极的作用。4．Ab-Rel在免疫反应中的功能与机理半定量RT-PCR、Real-time荧光定量PCR、Norther杂交和EMSA的结果显示，大肠杆菌脂多糖(LPS)不能刺激鲍血淋巴细胞中Ab-Rel的表达，但可以使血淋巴细胞中NF-κB的DNA结合活性增加，表明鲍核转录因子Ab-Rel在免疫反应中具有调节作用，而其功能的激活发生在转录后。试验结果证明了NF-κB在鲍免疫反应中的作用，从而表明NF-κB信号通路在腹足类动物中的保守性。5．Ab-Rel在昆虫细胞中的表达与亚细胞定位利用Bac to Bac杆状病毒-昆虫细胞表达系统对Ab-Rel基因进行表达，通过与绿色荧光蛋白(EGFP)相融合，对Ab-Rel在昆虫细胞中进行了亚细胞定位。结果表明，鲍Ab-Rel基因能在昆虫细胞中获得表达，EGFP-Ab-Rel的融合蛋白定位于细胞核中。6．双抗体间接ELISA检测鲍NF-κB利用两个抗体对鲍NF-κB进行ELISA检测，与只用一个抗体的间接ELISA方法相比，该技术得利于抗体与抗原间有更多的结合位点，当加入酶标二抗和显色底物时，反应信号将会成倍放大。这种利用双抗体与二抗联用的间接ELISA方法更为灵敏，且操作简单，省时、省力，尤其适用于检测如NF-κB这样表达量较低的细胞因子。以此方法从蛋白水平上证明了Ab-Rel存在于鲍不同组织中，但血淋巴细胞中Ab-Rel蛋白的含量相对较多，进一步说明Ab-Rel蛋白在鲍免疫反应中的作用。7．磁捕获技术在NF-κB分离与检测中的应用本试验在上述研究的基础上提出一种新的磁捕获技术方案，用于分离和检测该DNA结合蛋白。通过优化实验条件，我们成功地从鲍血细胞蛋白中分离出了Ab-Rel蛋白。为了进一步证明该方法的实用性，我们对在昆虫细胞中表达的重组Ab-Rel蛋白进行分离，结果表明磁捕获技术不仅能有效地分离内源性NF-κB，而且对体外重组的NF-κB蛋白同样有效。因为只有具DNA结合活性的蛋白才能被捕获分离，所以磁捕获技术在分离蛋白的同时，还可以鉴定其活性。该技术的建立将有助于在蛋白水平研究NF-κB信号通路。

全文目录

致谢  6-7
中文摘要  7-10
引言  10-12
第一章核因子-KB结构和功能的研究进展  12-29
  1.Rel/NF-κB蛋白  12-14
  2.NF-κB的信号传导  14-17
  3.NF-κB功能结构域  17-19
  4.NF-κB的功能  19-21
  5.NF-κB与疾病  21-22
  6.NF-κB活性的抑制及其意义  22-23
  参考文献  23-29
第二章 Ab-Rel全长cDNA的克隆与序列分析  29-45
  1 材料与方法  29-38
  2 结果  38-41
  3 讨论  41-45
第三章 Ab-el的原核表达,蛋白活性分析与鲍NF-KB分子结构的鉴定  45-58
  1 材料与方法  45-50
  2 结果  50-56
  3 讨论  56-58
第四章 Ab-Rel的表达分析  58-66
  1 材料与方法  58-62
  2 结果  62-64
  3 讨论  64-66
第五章 Ab-Rel在免疫反应中的功能与机理研究  66-74
  1 材料与方法  66-69
  2 结果  69-70
  3 讨论  70-74
第六章 Ab-Rel的真核表达与亚细胞定位  74-84
  1 材料与方法  74-76
  2 结果  76-82
  3 讨论  82-84
第七章双抗体间接ELISA检测鲍NF-KB  84-89
  1 材料与方法  84-85
  2 结果  85-87
  3 讨论  87-89
第八章磁捕获技术在NF-KB分离与检测中的应用  89-98
  1 材料与方法  90-92
  2 结果  92-96
  3 讨论  96-98
全文小结  98-101
  1.主要结论  98-99
  2.主要创新点  99-100
  3.进一步研究方向  100-101
参考文献  101-107
ABSTRACT  107-115
附录A 攻读博士期间所发表的论文  115-116
附录B 本文所用缩略语  116

鲍（Haliotis diversicolor supertexta）核转录因子Ab-Rel的功能与特性分析及分子检测方法的建立

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