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Molecular Diagnosis of Malvastrum Leaf Curl and Tomato Yellow Leaf Curl Diseases in Fujian and Zhejiang Provinces, China

作　者: Roy Bundi Mugiira
导　师: Zhou Xueping
学　校: 浙江大学
专　业: Plant Pathology
关键词: 分子诊断番茄黄化曲叶病毒台湾番茄曲叶病毒广东赛葵曲叶病毒 Geminivirus Begomovirus 福建浙江
分类号: S436.412
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

双生病毒是一类具有孪生颗粒形态的植物单链DNA病毒，近年来已在世界范围内的多种作物上造成毁灭性危害，给作物生产造成了严重损失。近期，在中国南方地区的杂草和农作物上相继分离到多种粉虱传菜豆金色花叶病毒属双生病毒。对双生病毒引起的病害进行准确诊断是有效控制该类病毒的前提。鉴于双生病毒产生症状较类似，而且还存在复合侵染现象，因此仅凭病毒的症状还无法准诊，而分子生物学方法诊断则具有准确、可靠的特点。本文利用分子诊断方法，对发生在浙江、福建等地的赛葵曲叶病和番茄黄化曲叶病的病原进行了分子症断。从福建省采集了6份赛葵样品(FJ1、FJ2、FJ3、FJ4，FJ5和FJ6)，均表现为叶片卷曲和脉增厚症状，用CTAB法提取总DNA进行分子检测。利用双生病毒共同区的保守引物PA／PB对总DNA进行PCR扩增，获得大约500 bp的病毒部分DNA片段，克隆测序后的序列比较分析表明表明，这六份病毒样品属同一种双生病毒，序列同源性为98-100％，与此前报道的广东赛葵曲叶病毒序列同源性最高，为90-93％。选取FJ3分离物进行全序列克隆和测序，其全长为2765个核苷酸，具有典型的双生病毒基因组特征。序列同源性分析表明其与广东赛葵曲叶病毒(Malvastrum leaf curl Guangdong virus)的同源性达92.9％，为广东赛葵曲叶病毒的一个分离物，命名为广东赛葵曲叶病毒FJ3分离物(MLCuGdV-[FJ3])。PCR及southern blot分析表明这些福建分离物未伴随有卫星DNAβ分子，这也与此前的报道一致。系统进化分析显示，MLCuGdV-[FJ3]与其它已报道的侵染赛葵的双生病毒分离物亲缘关系很低，而与分离自同一生态区侵染番木瓜的双生病毒分离物具有很高的亲缘关系。各个ORF的氨基酸序列比较表明FJ3是一个种间重组病毒，可能是由中国番木瓜曲叶病毒或广东番木瓜曲叶病毒及其它未知病毒重组产生的。番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)和番茄曲叶病毒(Tomato leaf curl virus，ToLCV)是两类在热带和亚热带地区最具毁灭性的番茄病毒病，起源中心为中东地区和地中海盆地，并向世界其它地区蔓延。至2006年以前中国大陆未报道有番茄黄化曲叶病毒危害，浙江省也未报道有双生病毒。而在2006年秋浙江省地区田间种植的番茄出现了叶片卷曲、矮小等双生病毒侵染的症状。为了确定其病原，我们利用分子诊断的方法在浙江省范围内展开了病害诊断调查。从浙江省不同地区采集表现叶片卷曲黄化及矮缩等症状的番茄叶片样本，提取叶片组织总DNA，利用引物对PA／PB扩增病毒部分DNA序列(约500bp)并克隆测序。对所得的病毒分离物部分DNA序列分析表明28个样本分为两类：类型1与此前报道的番茄黄化曲叶病毒具有很高的同源性(98-99％)，类型2与已报道的台湾番茄曲叶病毒(Tomato leaf curl Taiwan virus，ToLCTWV)高度同源(97-98％)。随机选取3个TYLCV分离物和2个ToLCTWV分离物进行全序列克隆和测序，序列比对分析显示这两类病毒分离物各自的同源性很高(98-99％)。PCR与Southern blot分析没有检测到卫星DNAβ分子。为了完成柯赫氏法则要求以解决ToLCTWV的病原学问题，我们构建了ZJ16的侵染性克隆并利用农杆菌介导侵染植株。接种本氏烟和番茄苗14天后出现轻微的叶片黄化和脉间突起，症状观察正在继续进行。

全文目录

Dedication  4-5
Acknowledgement  5-7
Table of Contents  7-9
List of Figures  9-11
List of Tables  11-12
Abbreviations  12-13
Summary  13-16
摘要  16-18
1. General Introduction  18-22
  1.1 Background information  18-21
  1.2 Research objectives  21-22
    1.2.1 General objective  21
    1.2.2 Specific objectives  21-22
2. Literature Review  22-38
  2.1 Geminivirus plant pathogens  22-23
  2.2 Geminivirus taxonomy and genome organization  23-30
    2.2.1 Genus Mastrevirus  23-24
    2.2.2 Genus Curtovirus  24-25
    2.2.3 Genus Topocuvirus  25
    2.2.4 Genus Begomovirus  25-30
  2.3 Geminivirus genome replication and transcription  30-31
  2.4 Geminivectors  31-35
  2.5 Role of weed plant species in the etiology of begomovirus diseases  35-36
  2.6 Begomovirus diseases of the tomato crop  36-38
3. Experimental Procedures  38-47
  3.1 Extraction of total DNA  38-39
  3.2 PCR amplification of viral DNA fragments  39-41
    3.2.1 PCR Mix  39
    3.2.2 PCR Program for amplification of partial (～500 bp)viral DNA fragments  39-40
    3.2.3 PCR Program for amplification of complete (～2.7 kb) viral DNA  40
    3.2.4 PCR Program for amplification of putative satellite DNAβ (～1.3 kb)  40-41
  3.3 Cloning  41-42
    3.3.1 T-cloning  41-42
    3.3.2 Cloning in the expression binary vector pBinPLUS  42
  3.4 Transformation of plasmids into competent E. coli cells  42-43
  3.5 Restriction enzyme digests  43-44
    3.5.1 BamH1/EcoR1 double digestion of pMD 18-T-ZJ16full plasmid or pBinPLUS vector  43
    3.5.2 BamH1 digestion of pMD 18-T-ZJ 16full plasmid or pB inPLUS-ZJ 16-0.4mer  43-44
  3.6 Southern blot hybridization analysis  44-47
4. Molecular characterization of Malvastrum leaf curl Guangdong virus isolated from Fujian, China  47-58
  Abstract  47
  4.1 Introduction  47-48
  4.2 Materials and methods  48-51
    4.2.1 Sample collection  48-49
    4.2.2 Viral DNA cloning and sequencing  49
    4.2.3 Sequence analysis  49-50
    4.2.4 Southern blot hybridization analysis for DNAβ  50-51
  4.3 Results  51-56
  4.4 Discussion  56-58
5. Identification and characterization of tomato-infecting begomoviruses in Zhejiang Province, China  58-79
  Abstract  58
  5.1 Introduction  58-60
  5.2 Materials and methods  60-66
    5.3.1 Sample collection  60-61
    5.3.2 Virus DNA cloning and sequencing  61-62
    5.3.3 Sequence analysis  62
    5.3.4 Southern blot hybridization analysis for DNAβ  62-63
    5.3.5 Construction of ToLCTWV infectious clone and agro-inoculation of plants  63-66
  5.3 Results  66-74
  5.4 Discussion  74-79
References  79-93
Appendix 1: Virus genes deposited in the GenBank  93-95

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