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肾脏局部肾素血管紧张素系统在糖尿病肾病发生发展中的作用及机制研究

作　者: 刘英莉
导　师: 顾勇；陆福明；马骥；忻菁；林善锬
学　校: 复旦大学
专　业: 内科肾脏病学
关键词: AT1受体反义核酸肾脏局部肾素-血管紧张素系统 PKCβ活化糖尿病肾病 AT1_A嵌合体小鼠细胞外基质 AT1a基因敲除肾脏局部RAS 足细胞
分类号: R587.1
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

第一部分AT1受体反义核酸对大鼠肾脏局部肾素-血管紧张素系统的阻断作用目的：局部肾素-血管紧张素系统(RAS)在肾脏疾病的发生发展中可能起着重要作用，但受到研究手段的限制，迄今尚未得到直接的证明，其机制也不完全清楚。本研究应用单侧肾脏基因转移的方法研究血管紧张素Ⅰ型受体(AT1)反义(AS)寡核苷酸(ODN)对大鼠肾脏局部RAS的阻断作用。方法：采用单侧肾动脉注射+原位电穿孔的方法，将AT1 AS-ODN导入到Wistar大鼠的一侧肾脏，以FIFC荧光标记的ODN观察其在肾脏的转移位置，以AT1放射自显影定量分析的方法观察转移基因的时间-效应曲线。在基因转移3天后以RT-PCR、Western blot及免疫组织化学方法检测肾脏AT1的mRNA和蛋白表达与分布，并以正义(Sen)ODN转移、假注射+肾脏原位电穿孔(Sham)作为对照。结果：FITC标记的ODN在基因转移10分钟后主要定位于转移侧肾脏的肾小球，而对侧肾脏FITC荧光阴性。AT1放射自显影定量分析显示在基因转移后的3天内，结合有血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)的AT1可较未转移的对侧肾脏减少约70％。AT1 AS-ODN基因转移后3天，转移侧肾脏AT1 mRNA水平较对侧肾脏下降约43％，蛋白水平下降约67％，而与AT1 Sen-ODN和Sham组转移侧肾脏比较AT1的mRNA水平下降分别约47％和51％，蛋白水平下降分别约63％和71％。免疫组化检查发现AT1的阻断以系膜区的表达减少为主。结论：本研究所用的单侧肾动脉注射+原位电穿孔的基因转移方法成功地抑制了单侧肾脏的肾小球AT1受体的表达，为研究全身性疾病肾损害中肾脏局部RAS的短期作用机制提供了一个比较理想的整体动物模型。第二部分AT1受体反义核酸单侧肾脏转移对糖尿病大鼠肾脏PKCβ活化的影响研究目的：PKC的激活被认为是促进糖尿病肾病发病的重要环节之一，既往的研究表明PKC的活化与RAS系统的激活有关，随着对局部RAS认识的深入，我们希望探讨PKC的活化是否与肾脏局部RAS的兴奋有关。本研究通过单侧肾动脉注射+肾脏原位电穿孔的方法将AT1受体的反义基因转移到糖尿病大鼠的单侧肾脏，阻断单侧肾脏的RAS系统，并与氯沙坦阻断循环RAS的兴奋做比较，了解PKC的活化与肾脏局部RAS激活的关系。方法：：wistar大鼠(150g左右)，链脲佐菌素STZ 60mg／kg腹腔注射诱导糖尿病模型，血糖＞16.7mmol／l作为成模标准，3周后分别给予(n=5)：AT1antisense ODN单侧肾动脉注射+肾脏原位电穿孔：AT1 sense-ODN单侧肾动脉注射+肾脏原位电穿孔；假注射+原位电穿孔；假注射+氯沙坦50mg／kg／d灌胃。试验前后测动物血压，3天后处死动物取肾脏，RT-PCR及Western blot检测双侧肾脏AT1 mRNA及蛋白表达，PKC的活化用胞膜与胞浆PKC蛋白表达的比例表不。结果：大鼠血压在氯沙坦组明显下降(P＜0.05)，其他各组血压无明显变化，ATlantisense注射组和氯沙坦组的AT1蛋白表达较正常对照组下降分别为70.1％和76％(p＜0.05)，PKC胞膜与胞浆蛋白表达比例在ATlantisense注射组和氯沙坦组均明显下降，较正常对照组下降分别为79.1％和74％(p＜0.05)。结论：肾脏局部RAS的激活可影响糖尿病大鼠肾脏PKC的活化，该效应不依赖于循环RAS的效应。第三部分AT1_A受体基因对糖尿病嵌合体小鼠肾脏细胞外基质重塑影响研究目的：探讨AT1_A受体基因对糖尿病嵌合体小鼠肾脏细胞外基质的影响。方法：嵌合体(chimeric)小鼠全身组织包括肾脏由血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)1A型受体(AT1_A)野生型细胞(AT1_A+／+)和AngⅡ受体AT1_A基因敲除细胞(AT1_A-／-)两组不同克隆来源的细胞组成。AT1_A嵌合体(Chimeric)小鼠，腹腔注射链尿佐菌素(STZ，300mg／kg)诱导糖尿病模型12周后，取肾脏组织，连续冰冻切片作LacZ(β半乳糖苷酶)染色区分不同基因型的肾小球和PAS染色检测其细胞外基质的表达；免疫组化方法检测转化生长因子TGFβ1、纤溶酶原激活物抑制物PAI1、终末糖基化产物AGE、硝基酪氨酸nitrotyrosine的表达，比较两种基因型肾小球细胞外基质和各细胞因子的表达变化。结果：在糖尿病状态下，(AT1_A+／+)和(AT1_A-／-)肾小球细胞外基质均较对照组明显增多(P＜0.05)。两种基因型相比，AT1A-／-基因型的表达绝对值均高于AT1_A+／+基因型肾小球(P＜0.05)，但从正常状态到糖尿病其升高幅度却低于AT1_A+／+基因型肾小球(P＜0.01)。各种细胞因子在糖尿病状态下的表达也都明显增加(P＜0.05)，AT1_A-／-基因型的绝对数值也均高于AT1_A+／+基因型肾小球(P＜0.05)，但变化幅度均为AT1_A-／-基因型肾小球低于AT1_A+／+基因型肾小球(P＜0.01)。结论：AT1_A基因缺失使得部分肾小球代偿性上调TGFβ1、PAI1、AGE和nitrotyrosine的表达。AT1_A受体在一定程度上影响了TGFβ1、PAI1、AGE和nitrotyrosine的表达而参与了糖尿病小鼠肾脏细胞外基质的重塑，但并非独立决定因素。第四部分AT1a基因敲除小鼠中肾脏局部RAS对糖尿病肾病的影响及其机制的探讨目的：探讨在AT1a基因敲除小鼠中肾脏局部RAS的改变对糖尿病肾脏细胞外基质合成的影响及其可能机制方法：AT1a基因敲除小鼠和野生型小鼠，腹腔注射链尿佐菌素(S7Z，300mg／kg)诱导糖尿病模型12周后，取肾脏组织，冰冻组织切片用激光捕获微切割的技术分离肾小球，提取RNA，结合Real-time PCR的方法检测肾小球内AT1a、AT1b，AT2，angiotensin，ACE，肾素renin，醛固酮合成酶CYP11B2的mRNA表达，观察AT1a基因敲除小鼠中肾脏局部RAS的改变；PAS染色观察肾脏病理变化，免疫组化方法检测转化生长因子TGFβ1、纤溶酶原激活物抑制物PA11、单核细胞趋化因子MCP1和Renin的表达，比较两种基因型肾小球细胞外基质和各细胞因子的表达变化。结果：与野生型小鼠相比，在AT1a基因敲除的糖尿病小鼠肾小球内AT1b，angiotensin，renin，CYP11B2的表达明显上调(p＜0.05)，在AT1a基因敲除的小鼠肾小球中未检测到AT2的表达，在野生型小鼠肾脏中检测到微量的表达，且在糖尿病状态下表达下调，ACE无明显改变；与正常小鼠相比，两种基因型的糖尿病小鼠肾脏细胞外基质和TGFβ1、PAI1、MCP1和Renin的表达均明显增加(p＜0.05)，AT1a基因敲除的糖尿病小鼠较野生型糖尿病小鼠的肾脏病变更严重。结论：AT1a基因敲除不能使小鼠糖尿病肾脏病变减轻，并使得TGFβ1、PAI1、MCP1和Renin的表达上调；AT1b的上调和AT2的下调可能使得血管紧张素Ⅱ的生物活性继续得以发挥，renin的上调可能通过非血管紧张素途径参与了糖尿病肾病的进展，CYP11B2的上调提示肾脏局部可能有非血管紧张素途径的醛固酮合成。第五部分AT1a基因敲除对糖尿病状态下肾小球足细胞及其相关蛋白的影响目的：探讨在AT1a基因敲除对糖尿病状态下肾小球足细胞及其骨架蛋白的影响。方法：AT1a基因敲除小鼠和野生型小鼠，腹腔注射链尿佐菌素(STZ，300mg／kg)诱导糖尿病模型12周后，取肾脏组织，冰冻组织切片用激光捕获微切割的技术分离肾小球，提取RNA，结合Real-time PCR的方法检测肾小球内nephrin和α-actinin 4的mRNA表达，免疫组织化学的方法检测足细胞标志WT1的表达，免疫荧光的方法观察AT1a基因敲除对nephrin和α-actinin 4蛋白表达和分布的影响。结果：与野生型小鼠相比，在AT1a基因敲除的糖尿病小鼠肾小球内足细胞的数目无明显改变，nephrin的mRNA表达明显减少(p＜0.05)，蛋白表达也明显减少，并由线状分布变为点状分布。两种基因型的α-actinin 4的mRNA和蛋白表达在糖尿病状态下均明显减少，但两种基因型之间无明显差异。结论：糖尿病状态下，足细胞的相关蛋白nephrin和α-actinin 4表达减少，AT1a基因敲除使得nephrin的mRNA和蛋白表达在糖尿病状态下减少更明显。足细胞数目未受到影响。

全文目录

中文摘要  5-10
英文摘要  10-15
前言  15-17
第一部分 AT1受体反义核酸对大鼠肾脏局部肾素-血管紧张素系统的阻断作用  17-30
  前言  17
  材料与方法  17-22
  结果  22-23
  讨论  23-30
第二部分 AT1受体反义核酸单侧肾脏转移对糖尿病大鼠肾脏PKCβ活化的影响研究  30-40
  前言  30-31
  材料与方法  31-33
  结果  33
  讨论  33-40
第三部分 AT1_A受体基因对糖尿病嵌合体小鼠肾脏细胞外基质重塑影响研究  40-52
  前言  40
  材料与方法  40-42
  结果  42
  讨论  42-52
第四部分 AT1a基因敲除小鼠中肾脏局部RAS对糖尿病肾病的影响及其机制的探讨  52-69
  前言  52
  材料与方法  52-57
  结果  57-58
  讨论  58-69
第五部分 AT1a基因敲除对糖尿病状态下肾小球足细胞及其相关蛋白的影响  69-78
  前言  69
  材料与方法  69-70
  结果  70-71
  讨论  71-78
论文总结  78-80
参考文献  80-88
综述  88-99
附录  99-100
致谢  100-102

肾脏局部肾素血管紧张素系统在糖尿病肾病发生发展中的作用及机制研究

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