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古细菌视紫红质蛋白的质子泵机理及其与聚合物复合功能材料的研究

作　者: 明明
导　师: 丁建东
学　校: 复旦大学
专　业: 高分子化学与物理
关键词: 古紫质4(AR4)蛋白细菌视紫红质(BR)蛋白质子泵光循环 M中间体偶联效应 pH依赖性基因工程定点突变脂与蛋白相互作用
分类号: Q789
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

二十一世纪是学科交叉的世纪，是生物、信息和材料等领域相互交融的世纪。本论文研究两种膜蛋白——细菌视紫红质(BR)和古紫质4(AR4)质子泵机理的区别和联系，运用基因工程点突变的技术对两种膜蛋白进行改性，深入考察氨基酸序列和脂环境对它们质子泵功能及光循环性质的影响，并将这种具有生物活性的生命物质和具有良好加工性能的聚合物材料相结合制备成为功能复合材料。本课题涉及了高分子材料科学、生命科学以及信息科学领域。膜蛋白具有十分重要的生物功能，生命的基本单位——细胞与外界环境的能量转换、信息识别与传递、物质运送等基本生命过程主要通过其生物膜上的膜蛋白来完成。在过去的三十年里面，很少有单个的生物体能够像BR膜蛋白这样引起人们如此广泛的兴趣。人们相信这个简单的含有视黄醛的质子泵能够帮助我们开启离子泵机理奥秘之门，也看到了这种神奇的蛋白在应用上的巨大潜力。AR4蛋白是从在我国西藏盐湖中发现的一种嗜盐菌株中提取的含有视黄醛的膜蛋白，它与BR蛋白一样具有光驱质子泵功能。但与BR相比，AR4结构与功能的神秘面纱还未为世人所揭开，还需要我们进行不断地探索研究。BR蛋白是最早有技术应用的光至变色的生物分子之一，而BR／聚合物功能复合材料的制备是决定其应用前景的最为关键的技术之一。如何将AR4蛋白也应用于高级防伪和光信息存储与处理领域也是一个挑战性课题。基于此，本论文的主要创造性工作和成果为：(一)研究了AR4蛋白的光循环性质和质子泵机理，提出弱偶联模型解释AR4的特殊现象。在与BR相比较的基础上，考察了AR4质子泵功能和光循环性质的pH依赖性，测定了其几个关键氨基酸在光循环中各个状态的pK_a值，发现在高pH区域，AR4蛋白光循环中的质子提取与释放顺序发生反向，从而与BR蛋白在中性pH环境中的顺序一致。指出AR4光循环中，Asp85质子化与蛋白质子释放之间的弱偶联效应是导致AR4与BR蛋白光循环中相反的质子提取和释放顺序的原因。同时，还发现AR4中质子释放基团并没有失去功能，而是在催化质子受体Asp85的去质子化、加速AR4光循环最后过程中质子在质子释放通道内部的传递和AR4初态的回复上发挥了重要的作用。与BR相比，AR4是一个碱化了的质子泵。(二)研究了去垢剂Triton X-100对AR4蛋白质子泵功能的影响，发现蛋白质的自组装聚集状态对于AR4的质子泵功能有重要影响。发现Triton X-100可以改变AR4蛋白光循环中的质子提取与释放的顺序，AR4聚集体与AR4单体具有截然相反的质子提取与释放顺序。并且，用Biobeads去除体系的Trion X-100后，AR4蛋白的这种质子提取与释放顺序还可以得到恢复。表明脂与蛋白的相互作用及蛋白质的聚集状态在影响AR4中的Asp85质子化与质子释放之间的偶联作用，以及调节其光循环中质子泵次序方面起到了重要的作用。(三)研究了转基因AR4蛋白与野生AR4及BR蛋白质子泵功能的差异。通过合作研究，将AR4和BR基因在一株本身不合成菌紫质和玉红素的嗜盐菌株L33中克隆和表达，本论文发现：在L33中表达的AR4蛋白(称为转基因AR4蛋白)表现出与野生AR4蛋白以及BR蛋白都不相同的光循环和质子泵性质，其Asp85质子化与质子释放之间的偶联作用以及其他很多性质都介于野生AR4和BR之间。转基因AR4与BR蛋白具有相同的脂环境，其性质的差异由其不同的氨基酸序列所导致；而转基因AR4与野生AR4蛋白具有相同的氨基酸序列，其性质的差异归咎于其所不同的脂环境(转基因AR4的紫膜环境和野生AR4的紫红膜环境)。因此，我们提出AR4蛋白中一些特殊的氨基酸残基和其特殊的脂环境共同决定了其在光循环中与BR相反的质子提取与释放顺序。(四)研究了两种新型BR蛋白和AR4蛋白突变体，BR-D96V和AR4-D212G的质子泵功能和光循环性质，同时将野生BR、D96N BR和野生AR4蛋白作为它们性质研究的对照。将酸性氨基酸Asp96(D96)突变成了一个非常疏水的氨基酸Val(V)，并没有影响到BR蛋白基本的折叠结构，D96V BR同样具有质子泵功能，并且其光适应向暗适应的转变行为与野生BR相似。中性pH值条件下，D96V突变的BR蛋白光循环中M产物的寿命和野生BR相比有了一个数量级以上的延长，与D96N BR的M产物寿命接近。提高体系的pH值可以使D96V BR光循环中M产物寿命有着更加显著的延长。结果表明，该位点的基因突变修饰优化了BR蛋白作为光信息存储和处理材料的性能。AR4蛋白的D212G突变则改变了其光循环中的质子提取与释放顺序，从而使其与BR中的顺序一致，表明Asp212(D212)对AR4蛋白质子泵的次序有着至关重要的作用。(五)初步考察了重组的上述蛋白质与聚合物复合体系以及潜在的光信息材料。通过基因工程改性成功地使AR4蛋白具备了一定的潜在应用价值，并在聚合物和BR蛋白的改性以增强它们之间的相互作用、制备光学尺度均匀的复合材料上作出了探索。与BR相比，AR4中的玉红素掩盖了其吸收峰，削弱了其光致色变的反差，从而阻碍了其在光信息存储方面的可能应用。通过基因工程的方法成功去除了玉红素，并采用定点突变的方法优化其功能，将其包埋于聚合物中制成复合膜，采用简易的方法实现了其可视化的图像存储，使AR4蛋白也同样可以应用于信息存储和信息处理领域。在复合材料的制备研究中，使用两亲性的温度敏感水凝胶材料复合成膜或者凝胶，增强了蛋白与聚合物的相互作用，对制备分子尺度上均匀的BR光学材料进行了尝试。总之，本论文立足于材料、生物、信息交叉领域的研究与探索，在基础理论研究方向上，描绘了AR4蛋白质子泵机理的图像，加深和拓展了人们对膜蛋白离子泵机理的理解，丰富了人类知识的宝库；在应用开发方向上，无论在新的AR4材料方面还是新的聚合物复合制备技术方面都进行了探索，获得了自主的知识产权。

全文目录

摘要  6-9
Abstract  9-13
第一章绪论  13-41
  1.1 引言  13-15
  1.2 细菌视紫红质(BR)和古紫质4蛋白(AR4)  15-21
  1.3 细菌视紫红质的质子泵机理  21-27
  1.4 细菌视紫红质的技术应用  27-32
  1.5 本论文的研究背景和主要内容  32-34
  参考文献  34-41
第二章古紫质4蛋白的光循环与质子泵  41-72
  2.1 前言  41-44
  2.2 材料与方法  44-45
    2.2.1 古紫质4蛋白和细菌视紫红质蛋白的提取  44
    2.2.2 膜蛋白质子泵的测定  44
    2.2.3 动力学光谱仪测定膜蛋白光循环中的瞬态吸收变化  44-45
    2.2.4 膜蛋白吸收光谱的测定  45
  2.3 结果  45-56
    2.3.1 古紫质4蛋白的质子泵行为  45-48
    2.3.2 古紫质4蛋白的吸收光谱  48-49
    2.3.3 古紫质4蛋白紫膜向蓝膜的转变  49-51
    2.3.4 古紫质4蛋白的光循环  51-52
    2.3.5 古紫质4蛋白光循环中的M产物形成的pH依赖性  52-53
    2.3.6 古紫质4蛋白光循环中的O产物形成与衰减的pH依赖性  53-55
    2.3.7 古紫质4蛋白光循环中的O产物与质子提取和释放的关系  55-56
  2.4 讨论  56-62
    2.4.1 古紫质4蛋白光循环中质子提取与释放的顺序  56
    2.4.2 古紫质4蛋白的质子慢释放机理  56-58
    2.4.3 古紫质4蛋白中可能导致其质子释放弱偶联机理的氨基酸残基  58-60
    2.4.4 古紫质4蛋白中质子释放基团在光循环中的作用  60-61
    2.4.5 古紫质4蛋白中质子泵过程的几个关键步骤总结  61-62
  2.5 小结与展望  62-64
  参考文献  64-72
第三章脂与蛋白的相互作用对古紫质4质子泵功能的影响  72-92
  3.1 前言  72-73
  3.2 材料与方法  73-75
    3.2.1 古紫质4蛋白和细菌视紫红质蛋白的提取  74
    3.2.2 Triton X-100和Octyl glucoside溶解膜蛋白  74
    3.2.3 膜蛋白的离心分离  74
    3.2.4 膜蛋白吸收光谱和圆二色谱的测定  74
    3.2.5 动力学光谱仪测定膜蛋白的光循环和质子泵  74
    3.2.6 Biobeads去除蛋白溶液中的Triton X-100  74-75
  3.3 结果  75-84
    3.3.1 古紫质4与细菌视紫红质蛋白吸收光谱和圆二色谱的比较  75-77
    3.3.2 去垢剂对两种膜蛋白光循环中质子提取和释放顺序的影响  77-78
    3.3.3 Triton X-100对古紫质4蛋白M产物、吸收光谱和圆二色谱的影响  78-81
    3.3.4 古紫质4蛋白的聚集体和单体具有相反的质子提取与释放顺序  81-82
    3.3.5 去除Triton X-100后古紫质4蛋白质子提取与释放顺序的恢复  82-84
  3.4 讨论  84-86
    3.4.1 AR4单体中Asp85和质子释放基团之间的偶联力得以恢复  84
    3.4.2 古紫质4与细菌视紫红质蛋白脂环境的差别  84-85
    3.4.3 脂与蛋白的相互作用决定了古紫质4蛋白质子释放的弱偶联机理  85-86
  3.5 小结与展望  86-87
  参考文献  87-92
第四章重组古紫质4与野生古紫质4及细菌视紫红质性质的比较  92-116
  4.1 前言  93-94
  4.2 材料与方法  94-96
    4.2.1 基因工程所用材料  94
    4.2.2 BR基因的启动子区域和AR4基因开放读码框的PCR扩增  94-95
    4.2.3 AR4基因的序列测定  95
    4.2.4 AR4基因的克隆和表达  95
    4.2.5 膜蛋白的可见吸收光谱的pH滴定  95
    4.2.6 膜蛋白光循环和质子泵的pH滴定  95-96
  4.3 结果  96-106
    4.3.1 AR4蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳图案  96
    4.3.2 转基因AR4&BR与野生AR4&BR吸收光谱和质子泵行为的比较  96-98
    4.3.3 转基因AR4质子泵的pH滴定  98-99
    4.3.4 转基因AR4可见吸收光谱的pH滴定  99-103
    4.3.5 转基因AR4光循环中M产物和O产物的pH滴定  103-106
  4.4 讨论  106-109
    4.4.1 AR4基因在嗜盐菌株L33中的转化和表达  106
    4.4.2 转基因AR4与BR蛋白性质的差异  106-109
    4.4.3 转基因AR4与野生AR4蛋白性质的差异  109
  4.5 小结与展望  109-111
  参考文献  111-116
第五章基因工程定点突变的古紫质和细菌视紫红质的功能研究  116-133
  5.1 前言  116-118
  5.2 材料与方法  118-120
    5.2.1 野生BR&AR4蛋白的获取  118
    5.2.2 D96N突变和D96V突变的BR蛋白的获取  118-119
    5.2.3 D212G突变的AR4蛋白的获取  119
    5.2.4 膜蛋白质谱的测定  119
    5.2.5 膜蛋白吸收光谱和暗适应速率的测定  119-120
    5.2.6 膜蛋白光循环和质子泵的测定  120
  5.3 结果  120-127
    5.3.1 D96V突变的BR蛋白的质谱图  120-121
    5.3.2 D96V突变的BR蛋白的吸收光谱及光适应向暗适应的转变  121-122
    5.3.3 D96V突变的BR蛋白的光循环和质子泵  122-123
    5.3.4 D96V突变的BR蛋白光循环中M产物寿命的pH滴定  123-124
    5.3.5 D212G突变的AR4蛋白光循环中质子提取和释放顺序  124-125
    5.3.6 D212G突变的AR4蛋白紫膜向蓝膜的转变  125-127
  5.4 讨论  127-129
    5.4.1 D96V突变优化了BR蛋白作为光信息存储和处理材料的功能  127-128
    5.4.2 D96V突变的BR蛋白光循环中M产物衰减的分析  128
    5.4.3 D212G突变使AR4蛋白恢复了"正常"的质子提取和释放顺序  128-129
  5.5 小结与展望  129-130
  参考文献  130-133
第六章细菌视紫红质和古紫质4蛋白功能材料的制备和研究  133-151
  6.1 前言  133-135
  6.2 BR蛋白/PVA复合膜的制备及功能研究  135-137
  6.3 一种具有光学响应的古紫质聚合物复合膜及其制备方法  137-141
  6.4 一种基因突变的古紫质4蛋白以及与聚合物的复合膜和相关制备方法  141-144
  6.5 BR蛋白/两亲性温敏性水凝胶复合材料的制备和功能研究  144-146
  6.6 小结与展望  146-148
  参考文献  148-151
第七章总结与展望  151-154
  7.1 本论文的主要结论、主要成果及意义  151-152
  7.2 本论文的创新之处  152-153
  7.3 本论文工作的延续和展望  153-154
附录一嗜盐菌的培养和膜蛋白的提取  154-158
附录二动力学光谱仪的工作原理及使用方法  158-160
附录三二十种氨基酸分类表  160-162
附录四 AR4与BR的氨基酸序列比较  162-164
个人简历  164-166
Resume  166-168
论文发表与专利申请  168-170
致谢  170-172

古细菌视紫红质蛋白的质子泵机理及其与聚合物复合功能材料的研究

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