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黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分的制备及其生物活性的研究

作　者: 樊黎生
导　师: 张声华
学　校: 华中农业大学
专　业: 食品科学
关键词: 黑木耳多糖 AAP-Ⅱa级分 结构表征 抑菌作用 抑制肿瘤 延缓衰老 抗心肌缺血 作用机理
分类号: TS201.2
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
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内容摘要


黑木耳(Auricularia auricula)是我国重要的食用菌作物之一。黑木耳中含有大量的活性成分——黑木耳多糖。近代，由于黑木耳多糖具有重大保健价值而倍受学术界重视，本文在前人的工作基础上开展了对黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分的特性、结构以及生物活性，包括抗菌作用、抑制肿瘤作用、抗衰老抗心肌缺血及其分子作用机理等的系统研究。主要研究结果如下： 1 黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分的化学特性表征 将市售黑木耳干品去杂、粉碎、脱脂、浸提(超声波协同酶法)、离心或过滤、浓缩，醇沉、酶与Sevage复合法脱除蛋白质，经冷冻干燥后，即得黑木耳多糖。 黑木耳多糖的平均提取率为8.58％。采用DEAE Sephadex A-25色谱柱对脱除蛋白质后的黑木耳多糖进行分级，并用Sephadex G-200凝胶色谱柱纯化，得到黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分，该级分得率为4.59％。并对AAP-Ⅱa级分的纯度和理化特性进行了鉴定。经过液相色谱，纸层析分析说明，AAP-Ⅱa级分是由葡萄糖、岩藻糖、甘露糖、葡萄糖醛酸和鼠李糖组成的杂多糖，摩尔比例为11.52：1.27：1.00：0.61：0.23。凝胶柱层析法测得其平均分子量为165000。AAP-Ⅱa级分中中性糖含量为58.93％，葡萄糖醛酸的含量为33.82％；蛋白质含量为1.90％；钙、镁、硒、铁元素含量分别为：3.01mg／g、2.23mg／g、23.51μg／g和1.04mg／g。采用原子力显微镜和扫描电镜观察了多糖分子的形貌。推测糖分子在固态时是产生大的岛屿状的宏观聚集，分子间分子内结合致密。 2 黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分的抗菌效果研究 结果表明，AAP-Ⅱa级分对大多数革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌均有较强的抑菌作用，对部分酵母菌也有良好的抑制生长作用，且抑菌所需浓度低，抑菌pH值作用范围广、热稳定性强，其抗菌效果略低于苯甲酸钠，对霉菌没有明显的抑制作用。 3 黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分对肝癌H22细胞的生长抑制作用 通过体内给药，结果显示AAP-Ⅱa级分能显著抑制肝癌H22细胞的生长，同时明显提高了荷瘤小鼠的免疫器官重量，促进小鼠淋巴细胞的增殖作用和迟发型超敏反应强度，增强免疫作用等，其作用效果与剂量呈正相关。上述结果提示，AAP-Ⅱa级分的体内抗肿瘤活性是通过增强机体的免疫活性来实现的。另外它可使荷瘤小鼠血清的SOD含量升高，MDA值降低。说明其抗肿瘤活性还与其抗氧化活性有关。

全文目录


摘要  12-14
ABSTRACT  14-17
英文缩略语表  17-18
前言  18-31
  1 黑木耳多糖的研究进展和现状  19-24
    1.1 黑木耳的营养价值与药用价值  19-20
    1.2 国内外研究现状  20-24
      1.2.1 黑木耳多糖的提取分离及化学研究现状  21-22
      1.2.2 黑木耳多糖的生物活性研究现状  22-24
  2 本研究的目的与内容  24-26
    2.1 课题研究的目的意义  24-25
    2.2 课题主要研究内容  25-26
  参考文献  26-31
第一章 黑木耳多糖从AAP-ⅡA级分的制备与纯度鉴定  31-53
  0 引言  31-32
  1 材料与方法  32-39
    1.1 主要试剂与实验材料  32-33
    1.2 主要仪器与设备  33-34
    1.3 实验方法  34-39
      1.3.1 黑木耳粗多糖的提取工艺流程  34
      1.3.2 黑木耳粗多糖的得率计算  34
      1.3.3 黑木耳粗多糖的含量测定  34-35
      1.3.4 不同提取剂对黑木耳粗多糖得率的影响  35
      1.3.5 黑木耳粗多糖提取条件的正交优化实验  35
      1.3.6 超声波法-酶法联合处理条件的实验  35-36
      1.3.7 不同干燥工艺对黑木耳粗多糖性质的影响  36
      1.3.8 黑木耳粗多糖(CAAP)的纯化试验  36
      1.3.9 蛋白质含量的测定  36
      1.3.10 黑木耳多糖的扫描电镜观察  36-37
      1.3.11 黑木耳多糖的分级纯化  37
      1.3.12 黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分的纯度鉴定  37-38
      1.3.13 统计分析  38-39
  2 结果与分析  39-50
    2.1 原料产地对黑木耳子实体主要组成成分含量的影响  39
    2.2 黑木耳的采收季节对黑木耳子实体主要组成成分含量的影响  39-40
    2.3 不同提取剂对黑木耳多糖得率的影响  40-41
    2.4 超声波与纤维素酶联合处理实验结果  41
    2.5 CAAP提取工艺条件的优化效果  41-44
    2.6 不同干燥工艺对CAAP性质的影响  44-45
    2.7 不同方法对CAAP脱蛋白的纯化结果  45-46
    2.8 黑木耳多糖(AAP)的SEM结果  46-47
    2.9 DEAE SephadexA-25色谱柱对黑木耳多糖的分级结果  47
    2.10 SephadexG-200色谱柱对黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分的分离纯化结果  47-48
    2.11 黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分的纯度与性质鉴定  48-49
      2.11.1 比旋光度的测定  48
      2.11.2 分子量的测定  48
      2.11.3 凝胶色谱柱层析法纯度鉴定结果  48-49
    2.12 黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分的基本理化性质鉴定  49-50
  3 结果与讨论  50-51
  参考文献  51-53
第二章 黑木耳多糖AAP-ⅡA级分的基本化学结构表征  53-74
  0 引言  53
  1 材料与方法  53-60
    1.1 主要试剂与实验原材料  53-54
    1.2 主要仪器与设备  54
    1.3 实验方法  54-60
      1.3.1 黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分单糖组成成分的测定  54-56
      1.3.2 黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分的红外图谱测定  56
      1.3.3 ~1HNMR和~(13)CNMR分析  56
      1.3.4 黑木耳多糖AAP-Ⅱa中性糖、葡萄糖醛酸含量的测定  56-57
      1.3.5 刚果红实验  57
      1.3.6 高碘酸氧化实验  57
      1.3.7 黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分中金属元素含量的测定  57-59
      1.3.8 原子力显微镜观察黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分分子的形貌  59
      1.3.9 黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分的扫描电镜观察  59-60
  2 结果与分析  60-70
    2.1 纸层析结果  60-61
    2.2 HPLC法检测单糖组成成分  61-63
    2.3 黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分的红外图谱分析  63
    2.4 刚果红实验结果分析  63-64
    2.5 高碘酸氧化结果  64-65
    2.6 核磁共振氢谱及碳谱分析  65-68
    2.7 原子力显微镜观察多糖分子的形貌  68-70
    2.8 黑木耳多糖-Ⅱa的扫描电镜观察结果  70
  3.结论与讨论  70-72
  参考文献  72-74
第三章 黑木耳多糖AAP-ⅡA级分的抗菌效果研究  74-82
  0 引言  74
  1 材料与方法  74-76
    1.1 主要实验材料  74-75
      1.1.1 黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分  74
      1.1.2 供试菌种  74-75
      1.1.3 培养基  75
      1.1.4 主要试剂与仪器  75
      1.1.5 菌悬液制备  75
    1.2 实验方法  75-76
      1.2.1 滤纸片法测定抗菌作用  75
      1.2.2 最低抑菌浓度(MIC)的测定  75-76
      1.2.3 抑菌pH值范围测定  76
      1.2.4 黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分抗热性的测定  76
  2 结果与分析  76-79
    2.1 黑木耳多糖AAF-Ⅱa级分的抑菌效果  76-77
    2.2 黑木耳多糖AAF-Ⅱa级分对各种待试菌的MIC  77-78
    2.3 黑木耳多糖AAF-Ⅱa级分抑菌pH值范围  78
    2.4 抗热性测定结果  78-79
  3 结果与讨论  79-80
  参考文献  80-82
第四章 黑木耳多糖AAP-ⅡA级分抗肿瘤作用的研究  82-96
  0 引言  82-83
  1 材料与方法  83-87
    1.1 材料  83-85
      1.1.1 实验材料  83
      1.1.2 主要试剂  83-84
      1.1.3 主要仪器  84-85
    1.2 实验方法  85-87
      1.2.1 接种方法  85
      1.2.2 分组及实验方法  85
      1.2.3 肿瘤抑制实验  85
      1.2.4 迟发型超敏反应(DTH,delayed type of hypersensitivity)  85
      1.2.5 NK细胞活性  85-86
      1.2.6 T淋巴细胞增殖功能  86
      1.2.7 黑木耳多糖AAP-Ⅱa对小鼠血清MDA的影响  86
      1.2.8 黑木耳多糖AAP-Ⅱa对小鼠血清SOD的影响  86
      1.2.9 组织切片病理学观察  86-87
      1.2.10 统计方法  87
  2 实验结果与分析  87-92
    2.1 黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分对荷H22瘤小鼠的抑瘤作用和对小鼠免疫器官的影响  87-88
    2.2 黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分对荷肝癌H22小鼠迟发型超敏反应的影响  88
    2.3 黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分对荷肝癌H22小鼠血清MDA的影响  88-89
    2.4 黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分对荷肝癌H22小鼠NK细胞活性的影响  89-90
    2.5 黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分对肝癌H22小鼠T淋巴细胞增殖功能的影响  90
    2.6 黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分对肝癌H22小鼠血清SOD的影响  90-91
    2.7 肿瘤组织病理学观察  91-92
  3 小结  92-93
  4 讨论  93-94
  参考文献  94-96
第五章 黑木耳多糖AAP-ⅡA级分抗衰老活性的研究  96-110
  0 引言  96-97
  1 材料与方法  97-100
    1.1 材料  97-98
      1.1.1 黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分  97
      1.1.2 主要试剂与实验原材料  97
      1.1.3 主要仪器  97
      1.1.4 实验动物  97-98
    1.2 实验方法  98-100
      1.2.1 黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分对小鼠体内抗氧化作用的影响  98
      1.2.2 果蝇生存实验  98
      1.2.3 黑木耳多糖／AAP-Ⅱa级分对半乳糖衰老模型小鼠体内抗氧化作用的影响  98-99
      1.2.4 测定方法  99
      1.2.5 数据处理  99-100
  2 结果与分析  100-106
    2.1 黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分对衰老小鼠的影响  100
      2.1.1 黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分对小鼠体重的影响  100
      2.1.2 黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分对小鼠体重、血清MDA和红细胞SOD的影响  100
    2.2 黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分对果蝇寿命的影响  100-101
    2.3 黑木耳多糖LAP-Ⅱa级分对半乳糖衰老模型小鼠的影响  101-106
      2.3.1 黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分对小鼠体重的影响  102
      2.3.2 黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分对半乳糖衰老模型小鼠器官的影响  102-103
      2.3.3 黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分对半乳糖衰老模型小鼠体内丙二醛(MDA)的影响  103-104
      2.3.4 黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分对半乳糖衰老模型小鼠体内SOD活性的影响  104-105
      2.3.5 黑木耳多糖AAP-Ⅱa对半乳糖衰老模型小鼠体内GSH-Px活性的影响  105-106
      2.3.6 黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分对半乳糖衰老模型小鼠体内脂褐素含量的影响  106
  3 结论与讨论  106-107
  参考文献  107-110
第六章 黑木耳多糖AAP-ⅡA级分抗衰老作用的分子机理研究  110-129
  0 引言  110-112
  1 材料与方法  112-116
    1.1 材料药品试剂  112-113
    1.2 主要仪器  113
    1.3 实验动物  113
    1.4 实验方法  113-116
      1.4.1 试验分组及给药  113-114
      1.4.2 称重、细胞制备与激活  114
      1.4.3 细胞活力测定  114
      1.4.4 DNA提取及凝胶电泳检测  114
      1.4.5 流式细胞仪分析  114-115
      1.4.6 细胞总RNA的提取  115
      1.4.7 引物设计  115
      1.4.8 逆转录反应  115-116
      1.4.9 PCR扩增  116
      1.4.10 PCR产物定量  116
      1.4.11 数据处理  116
  2 结果与分析  116-124
    2.1 小鼠体重、胸腺重及胸腺细胞活力测定  116-117
    2.2 琼脂糖凝胶电泳分析  117-118
    2.3 流式细胞仪检测结果  118-122
      2.3.1 黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分对小鼠胸腺细胞周期的影响  118-120
      2.3.2 黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分对小鼠胸腺细胞凋亡和凋亡率的影响  120-122
    2.4 黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分对小鼠胸腺细胞凋亡相关基因mRNA表达情况分析  122-124
      2.4.1 黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分对小鼠胸腺细胞Fas基因表达水平的影响  122-123
      2.4.2 黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分对小鼠胸腺细胞Bcl-2基因表达水平的影响  123-124
  3 结论与讨论  124-126
  参考文献  126-129
第七章 黑木耳多糖AAP-ⅡA级分抗心肌缺血的实验研究  129-140
  0 引言  129
  1 材料与方法  129-132
    1.1 材料药品试剂  129-130
    1.2 主要仪器与设备  130
    1.3 实验动物  130
    1.4 实验方法  130-132
      1.4.1 大鼠实验性缺血再灌注模型建立  130-131
      1.4.2 分组与操作  131
      1.4.3 指标检测  131
      1.4.4 梗塞范围  131
      1.4.5 实验性动脉血栓形成模型的制备  131-132
      1.4.6 诱导血小板凝集的方法  132
      1.4.7 数据处理  132
  2 结果与分析  132-137
    2.1 黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分对心外膜心电图的影响  132-133
    2.2 黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分对心肌梗死范围的影响  133
    2.3 黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分对血压、心率的影响  133-134
    2.4 黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分对心肌缺血鼠NO和ET含量的影响  134-135
    2.5 黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分抗大鼠实验性心肌缺血后脂质过氧化的作用  135
    2.6 黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分对心肌缺血鼠前列环素和血栓素的影响  135-136
    2.7 黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分抗实验性动脉血栓形成的作用  136
    2.8 黑木耳多糖AAP-Ⅱa级分抗血小板聚集作用  136-137
  3 结论与讨论  137-138
  参考文献  138-140
第八章 结论  140-144
第九章 文献综述：食药用真菌多糖生物活性研究  144-175
致谢  175-176
附录一 图表目录(按先后顺序排列)  176-179
附录二 攻读学位期间发表论文  179

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中图分类: > 工业技术 > 轻工业、手工业 > 食品工业 > 一般性问题 > 基础科学 > 食品化学
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