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肠球菌肽脱甲酰基酶pdf基因的克隆、分离与酶活性研究及以PDF为靶点的高通量新药筛选模型的建立与应用

作　者: 唐先兵
导　师: 张月琴
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 肠球菌同源序列大肠杆菌万古霉素发酵液开放阅读框抑制剂甲硫氨酸筛选模型肺炎链球菌
分类号: R965.1
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

刀古霉素曾一度被誉为“人类对付多重耐药G~+细菌感染的最后一道防线”，但随着耐万古霉素肠球菌(Vancomycin Resistant Entorecoeeus，VRE)的出现，这最后一道防线也面临崩溃。因此，针对目前耐药病原微生物的发展势态，研发出更多更有效的抗菌新药已十分迫切。众所周知，药物作用新靶点的发现及相应的筛选新模型的建立是发现创新药物的关键。肽脱甲酰基酶(peptidedeformylase，PDF)存在于所有原核生物中，是其生长、代谢、繁殖所必不可少的关键酶，但它不存在于人类与其他哺乳动物细胞。因而，Dan Ferbe等在发表于2002年2月Science上的一篇文章中，将肽脱甲酰基酶视为新一代广谱抗生素筛选最理想的分子靶点之一。本研究采用生物信息学方法将已知大肠杆菌、肺炎链球菌的PDF氨基酸序列与NCBI Gene bank中部分测序的肠球菌(Enterococcus faecium)基因组进行BLAST比较，获得肠球菌PDF同源序列。在该同源序列中含有其他微生物PDF酶活性必须的三个保守基序：Motifl{GXGXAAXQ}、Motif2{EGCLS}和Motif3{HEXDH}。通过基因序列比对分析，确定肠球菌中PDF同源序列的开放阅读框(open reading frame，ORF)，用PCR扩增出该开放阅读框并进行测序分析。该扩增的肠球菌PDF同源序列与原核蛋白表达载体pET-30-a(+)连接后，转化蛋白表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达。纯化诱导表达蛋白，使纯度达到90％以上。肠球菌PDF酶活性分析包括：酶与甲酰化三肽底物For-Met-Val-Ser相互作用的动力学特点，以及温度、pH对酶活力的影响。通过酶活性研究与Western blot分析证实了所获得的肠球菌PDF同源序列即为肠球菌的肽脱甲酰基酶基因，并将首次分离得到的肠球菌pdf登入NCBI Gene bank(Gene bank Accession number AY238515)。以纯化的肠球菌PDF为靶点，首次建立了体外筛选其拮抗剂的分子高通量筛选模型，并用此模型筛选了近10，000个样品，其中化合物样品为2，000个，微生物酵液样品为8，000个。在近10，000样品中，获得10个抑酶阳性样品，

全文目录

主要英文缩略  3-4
中文摘要  4-6
英文摘要  6-8
前言  8-11
材料  11-15
方法  15-38
结果  38-68
讨论  68-74
结论  74-75
本研究创新之点  75-76
参考文献  76-79
发表的文章与获奖情况  79-80
综述1 肽脱甲酰基酶:新一代广谱抗生素筛选优良靶点的研究进展  80-90
综述2 耐万古霉素肠球菌耐药机制研究进展  90-102
致谢  102

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