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Ⅰ. VEGF受体KDR、FLT-1结合小肽对血管形成和肿瘤生长的抑制 Ⅱ. 栝楼冠瘿组织、毛状根的培养及天花粉蛋白的产生

作　者: 雷和田
导　师: 杨峻山；寿成超
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 生药学
关键词: VEGF VEGF受体KDR/FLT-1 小肽融合蛋白 小肽 抑制新生血管形成 抗肿瘤生长和转移 栝楼 Ti质粒转化 冠瘿组织培养 冠瘿组织培养再生植株 Ri质粒转化 双转化毛状根培养 Southern blot Western blot 生物反应器培养 纯化TCN 抑制肿瘤细胞生长
分类号: R730.5
类　型: 博士论文
年　份: 2002年
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内容摘要


新生血管形成是直径超过0.5-1mm实体瘤生长和转移所必需。血管内皮细胞生长因子(VEGF)是一个血管内皮细胞的促分裂原和新生血管形成因子，它结合酪氨酸激酶受体KDR／FLK1和FLT-1能促进新生血管形成。筛选封闭VEGF与其受体KDR／FLT-1相互作用的小肽可以通过阻断新生血管形成而抑制实体瘤生长和转移。 既往以具有生物学活性的VEGF可溶性受体FLT-1、KDR为靶分子，通过生物淘筛(Bio-panning)从噬菌体展示12肽库中筛选获得了一个能与KDR结合的阳性克隆K237和两个能与FLT-1结合的阳性克隆F56、F90。本实验根据小肽K237、F56、F90的氨基酸序列合成了相应的核苷酸片段，然后将其克隆到二氢叶酸还原酶(DHFR)原核表达载体pQE42中，在大肠杆菌M15中稳定表达二氢叶酸还原酶融合蛋白DHFR-K237／F56／F90；经变性、复性同步纯化后得到纯度达90％的可溶性蛋白。 酶联免疫吸附法显示，DHFR-F56／F90能与可溶性受体FLT-1结合、DHFR-K237能与可溶性受体KDR结合；免疫细胞化学实验表明，DHFR-F56／F90／K237能与人脐静脉内皮细胞结合。竞争抑制实验显示，DHFR-F56和合成小肽F56能竞争抑制VEGF结合FLT-1，DHFR-K237和合成小肽K237能竞争抑制VEGF结合KDR；~3HTdR掺入实验表明DHFR-K237和合成小肽K237能显著抑制由VEGF刺激而引起的人脐静脉内皮细胞增殖。鸡胚尿囊膜血管增生抑制实验表明，DHFR-F56／K237及合成小肽F56、K237能显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜新生血管形成。BALB／c裸鼠成瘤实验显示小肽融合蛋白DHFR-F56与DHFR-K237能显著抑制荷瘤裸鼠中肿瘤的生长和促进肿瘤组织坏死，且免疫组织化学实验提示DHFR-F56能定位于肿瘤部位与人胃癌MGC803细胞结合。SCID小鼠成瘤实验显示合成小肽F56、K237能显著抑制荷瘤裸鼠中肿瘤

全文目录


第—部分 VEGF受体KDR、FLT-1结合小肽对血管形成和肿瘤生长的抑制  9-92
  中文摘要  9-10
  英文摘要  10-12
  文献综述  12-24
    1 肿瘤新生血管形成  12-16
      1.1 肿瘤细胞中VEGF的产生  12-13
      1.2 VEGF与其受体KDR、FLT-1的相互作用  13-14
      1.3 Angiopoietin-1／2、VEGF与Tie-2的相互作用  14-16
    2 小肽与抗肿瘤血管形成  16-20
      2.1 合成来源于基质蛋白TSP-1结构域的肽具有抗血管生成活性  17
      2.2 合成来源于纤连蛋白的短肽抑制鼠黑色素瘤细胞的转移  17
      2.3 具RGD(Arg-Gly-Asp)的小肽与αV整合素具高亲和力  17-18
      2.4 结合VEGF中受体结合结构域的短肽  18-19
      2.5 封闭VEGF受体KDR的7肽  19-20
    3 参考文献  20-24
  前言  24-26
  一 材料和方法  26-56
    1.1 实验材料及溶液配制  26-33
    1.2 可溶性VEGF受体FLT-1的制备  33-38
    1.3 GST-VEGF与GST-KDR的表达及纯化  38
    1.4 ELISA检测phage-F56／F90／K237的结合活性  38-39
    1.5 高滴度阳性噬菌体的制备  39-40
    1.6 小肽融合蛋白的表达及纯化  40-43
    1.7 竞争性实验检测小肽融合蛋白的结合活性  43-44
    1.8 抗DHFR单克隆抗体的制备  44-51
    1.9 Western blot检测小肽融合蛋白  51
    1.10 人脐静脉内皮细胞的原代培养  51
    1.11 ELISA检测小肽融合蛋白与可溶性受体的结合  51-52
    1.12 免疫细胞化学方法检测小肽融合蛋白与人脐静脉内皮细胞的结合  52-53
    1.13 ~3HTdR掺入实验  53
    1.14 鸡胚尿囊膜血管形成抑制实验  53-54
    1.15 动物实验  54-56
  二 结果和分析  56-78
    2.1 FLT-1胞外Ⅰ-Ⅳ区的克隆及原核表达  56-58
    2.2 阳性噬菌体克隆能特异结合相应靶分子  58
    2.3 小肽融合蛋白表达载体pQE42-F56／F90／K237的构建  58-59
    2.4 DHFR-F56／F90／K237的表达、纯化  59-61
    2.5 制备抗DHFR单克隆抗体  61-65
    2.6 Western blot检测小肽融合表达蛋白  65-66
    2.7 DHFR-F56／F90能结合FLT-1及DHFR-K237能结合KDR  66-67
    2.8 DHFR-K237抑制血管内皮细胞的增殖  67-69
    2.9 DHFR-F56／K237抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管的增生  69
    2.10 DHFR-F56／K237抑制荷人胃癌移植裸鼠瘤的生长  69-73
    2.11 合成小肽F56及K237竞争抑制VEGF结合其受体  73-74
    2.12 合成小肽K237抑制人脐静脉内皮细胞的增殖  74
    2.13 合成小肽F56及K237抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管形成  74-75
    2.14 小肽F56及K237抑制荷人乳腺癌移植SCID小鼠肿瘤的生长和转移  75-78
  三 讨论  78-86
    3.1 小肽融合蛋白的制备  79-81
    3.2 抗DHFR单克隆抗体的制备  81-82
    3.3 小肽融合蛋白及合成小肽的体外活性鉴定  82-83
    3.4 合成小肽及小肽融合蛋白的体内活性检测  83-86
  四 小结  86-87
  五 参考文献  87-92
第二部分 栝楼冠瘿组织、毛状根的培养及天花粉蛋白的产生  92-145
  中文摘要  92-93
  英文摘要  93-95
  文献综述  95-102
    1 天花粉蛋白的研究历史  95
    2 天花粉蛋白的物理和化学性质  95-96
    3 天花粉蛋白的结构  96-97
    4 天花粉蛋白与核酸分子的相互作用——天花粉蛋白的酶活性  97
    5 天花粉蛋白抗胃癌、结直肠癌的活性  97-102
  前言  102-103
  一 根癌农杆菌对栝楼的遗传转化  103-113
    1 材料和方法  103-106
      1.1 实验材料  103
      1.2 培养基  103-104
      1.3 冠瘿碱检测溶液的配制  104
      1.4 栝楼无菌苗的获得  104
      1.5 根癌农杆菌C58的保存与活化  104
      1.6 栝楼冠瘿组织的诱导和除菌  104
      1.7 栝楼冠瘿组织中冠瘿碱的测定  104-105
      1.8 基本培养基的筛选  105
      1.9 栝楼冠瘿组织培养条件的优化  105
      1.10 栝楼冠瘿组织在液体培养时生长与生产动态的研究  105-106
      1.11 栝楼冠瘿组织中总蛋白的测定  106
    2 结果和分析  106-111
      2.1 栝楼冠瘿瘤的诱导和除菌  106
      2.2 栝楼冠瘿组织基本培养基的筛选  106-107
      2.3 栝楼冠瘿组织培养条件的优化  107-110
      2.4 栝楼冠瘿组织细胞生长曲线及总蛋白含量的变化  110-111
      2.5 栝楼冠瘿组织中冠瘿碱的检测  111
    3 讨论  111-113
  二 Ti和Ri质粒对栝楼双转化的研究  113-120
    1 材料和方法  113-114
      1.1 发根农杆菌菌株的活化  113
      1.2 栝楼冠瘿组织诱导再生植株  113
      1.3 栝楼两种栝楼毛状根的获得及除菌  113
      1.4 冠瘿碱(nopaline)的检测  113
      1.5 甘露碱(mannopine)的检测  113-114
      1.6 栝楼毛状根的培养  114
      1.7 栝楼毛状根中总蛋白的测定  114
    2 结果和分析  114-118
      2.1 栝楼冠瘿组织再生植株  114
      2.2 栝楼双转化毛状根与普通毛状根的诱导及培养  114-115
      2.3 Ti和Ri质粒转化的初步证实  115-116
      2.4 栝楼两种毛状根的液体培养  116-118
    3 讨论  118-120
  三 栝楼冠瘿组织培养及其天花粉蛋白的产生  120-141
    1 材料和方法  120-128
      1.1 添加有机物对栝楼冠瘿组织培养的影响  120
      1.2 生物反应器技术在栝楼冠瘿组织培养时的应用  120-121
      1.3 Southern blot检测  121-126
      1.4 从栝楼块根和冠瘿组织中纯化天花粉蛋白  126
      1.5 抗天花粉蛋白多抗的制备  126-127
      1.6 Westernblot分析  127-128
      1.7 MTT比色法检测天花粉蛋白对肿瘤细胞生长的作用  128
    2 结果和分析  128-139
      2.1 添加有机物对冠瘿组织培养的影响  128-129
      2.2 搅拌式生物反应器能培养栝楼冠瘿组织  129-130
      2.3 Southern blot检测  130-135
      2.4 Western blot分析  135-137
      2.5 天花粉蛋白抑制人胃癌细胞生长  137-139
    3 讨论  139-141
  四 小结  141-142
  五 参考文献  142-145
主要缩略词  145-147
致谢  147-148
个人主要经历  148
攻读博士学位期间发表及待发表的文章  148-149
附：已发表论文复印件  149-166

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 一般性问题 > 肿瘤治疗学
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