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MnCl_2对大鼠睾丸支持细胞ABP、Tf和INHB mRNA转录及蛋白表达的影响

作　者: 孙钰铭
导　师: 陈小玉
学　校: 郑州大学
专　业: 卫生毒理学
关键词: 氯化锰支持细胞 Western blot 雄激素结合蛋白转铁蛋白抑制素B
分类号: R114
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的生殖健康是近些年讨论的热点,男性精液的质和量呈逐渐下降趋势,其影响因素是多方面的,环境污染是重要影响因素。在中国,由于生产工艺和技术的落后,以及管理不善,环保观念的薄弱,使得近些年的重金属污染情况日趋严重。锰作为重金属的一种,既是人体所需的微量元素之一,又是职业危害因素之一。锰参与人体的多种功能活动,微量的锰被机体吸收后,可进入睾丸组织参与精子的生成。锰缺乏时会出现性欲低下和不育,表现为生殖功能抑制,精子成熟受阻等；但过量的锰也会对雄性生殖系统产生影响,现有的研究表明,过量的摄入锰会对雄性生殖系统造成损伤,使睾丸萎缩、精子数量减少、畸形精子数增加等。该实验研究中,以原代培养大鼠睾丸支持细胞(Sertoli cell,SC)为模型,以氯化锰(MnCl2)为染毒物,用实时荧光定量PCR(real time Q-PCR)和Western blot方法检测MnCl2对支持细胞雄激素结合蛋白(Androgen binding protein,ABP)转铁蛋白(Transferrin,Tf)和抑制素B (Inhibin B.INH B)的mRNA转录水平和蛋白表达量的影响,探讨MnCl2对雄性生殖功能影响的作用机制,为进一步研究Mn对雄性生殖系统的毒性提供理论支持。方法1.支持细胞体外培养：选取18-20d的清洁级雄性Sprague Dawley大鼠,分离提取Sertoli细胞。2. Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测细胞生长状态：将Sertoli细胞以细胞浓度为2.0×104个/ml接种于96孔培养板,每板接种6个复孔,在450 nm测吸光度,绘制细胞生长曲线。3.MTT法确定染毒浓度：以1.0×10-2 mol/L、1.0×10-3 mol/L、1.0×10-4 mol/L、1.0×10-5 mol/L、1.0×10-6 mol/L、1.0×10-7 mol/L、1.0×10-8 mol/L、1.0×10-9 mol/L的MnCl2工作液染毒Sertoli细胞,培养24h,用酶标仪在492 nm测量吸光度,确定染毒浓度。4.荧光实时定量PCR法检测ABP、Tf和INH B mRNA的表达量：以50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L的MnCl2工作液染毒Sertoli细胞,染毒24h,提取Sertoli细胞的总RNA进行逆转录后,检测ABP、Tf和INH B mRNA的转录水平。5. Western blot法检测ABP, Tf和INHB的蛋白表达量：以50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L的MnCl2工作液染毒Sertoli细胞,提取Sertoli细胞的蛋白,用Western blot法检测ABP、Tf和INHB的蛋白相对表达量。结果1.细胞培养结果：通过两步酶法,提取的SD大鼠支持细胞存活率达到95%以上,培养48 h后细胞基本完全铺开,生长良好,经胰酶纯化后Sertoli细胞纯度达90%以上。2.CCK-8法测定结果：培养4-8 d的细胞数量相对比较稳定,代谢旺盛,选择培养至第5d的细胞进行研究。3.MTT法测定结果：检测各染毒组处理24 h后的Sertoli细胞OD值,经计算,IC50=200μmol/L选择1/4 IC5o、1/2 IC5o和IC50,即50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L为染毒浓度。4.荧光实时定量PCR结果：各浓度组Sertoli细胞ABP、Tf和INHBmRNA均能持续表达,三者的mRNA转录水平在各染毒组均降低,与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。5. Western blot结果：ABP蛋白相对表达量在各染毒组均降低,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；Tf的蛋白相对表达量在100μmol/L和200μmol/L两个浓度组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；INH B的蛋白相对表达量在200μmol/L浓度组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论氯化锰在该染毒剂量下可降低Sertoli细胞ABP、Tf和INH B mRNA转录及蛋白的表达水平,提示氯化锰可能通过抑制ABP、Tf和INHB基因表达而损伤支持细胞功能。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-10
中英文缩略词表  10-11
图和附表清单  11-12
1 引言  12-14
2 材料与方法  14-30
  2.1 材料  14-19
  2.2 实验方法  19-30
3 结果  30-43
  3.1 Sertoli细胞分离、培养  30-33
  3.2 Sertoli细胞生长状态  33-34
  3.3 MnCl_2染毒浓度确定  34
  3.4 MrCl_2对Sertoli细胞ABP、Tf和INHB mRNA转录水平的影响  34-38
  3.5 MnCl_2对Sertoli细胞ABP、Tf和INHB蛋白表达的影响  38-43
4 讨论  43-47
5 结论  47-48
参考文献  48-51
文献综述  51-68
  参考文献  63-68
个人简历在校期间发表的学术论文与研究成果  68-69
致谢  69

MnCl_2对大鼠睾丸支持细胞ABP、Tf和INHB mRNA转录及蛋白表达的影响

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