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DNA调节片段及其结合蛋白的筛选与鉴定

作　者: 张伸
导　师: 梁植权；刘德培
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 基因组进化 基因组调控 基因调控网络 基因调控信息传递网络 功能基因组 功能单元 虚拟细胞
分类号: Q75-3
类　型: 博士论文
年　份: 2002年
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内容摘要


一切生命现象，实际上都是机体产生的一系列复杂的信息传递和调控的过程。细胞水平的信息传递和调控是细胞各种行为的基础。从第一信使细胞外信号、第二信使、第三信使转录调节因子到靶基因，蛋白质之间的相互作用，蛋白质与基因调控序列之间的相互作用，通过编码DNA结合蛋白质的基因的表达，形成的基因调控信息传递网络，是细胞立体网络的一个核心部分。细胞的整体功能即是在基因调控信息传递网络的调控下，维持细胞内整个立体网络的稳定状态，并按照既定的内在程序分化、发育，或改进自身的结构以适应于环境。 疾病的形成与整个基因调控信息传递网络有关，要对基因调控信息传递网络和细胞行为有深入透彻的认识，首先要明确细胞内所有的基因，即基因组。基因组的研究对细胞内所有基因的克隆、鉴定起到巨大的推动作用。功能基因组研究主要包括以下各个部分：基因组、转录组、蛋白质组和代谢组等。功能基因组对细胞内的所有分子及它们之间的相互作用进行解析：确定出每一个功能单元的反应模式，浓度变化规律；确定出它们之间所有的相互作用和反应。即确定细胞立体网络中所有的结点和网络联系，得到网络的基本结构，作为理解和重建细胞功能的基础。 DNA与蛋白质之间的相互作用是构成基因调控信息传递网络的基础之一。通过DNA与蛋白质的相互作用，细胞基因组上的基因实现有序、协调表达，使细胞表现出有秩序和自组织的行为，如细胞的分裂与增殖，细胞的分化与凋亡，和个体有序的发育过程。已有的研究表明，反式作用因子与相应的DNA顺式作用元件的结合是染色质重塑和基因转录调节的基础。所以，筛选、鉴定DNA调节元件和DNA结合蛋白质，对研究基因调控信息传递网络和揭示基因表达调节和基因组自身组织规律是很有必要的。 现有的研究方法难以大量筛选、鉴定DNA调节元件，它们在筛选DNA调节片段时，或者效率不高，不能快速、大量筛选基因组中的DNA调节片段，或者需要纯化的转录因子和抗体，只能分离与已知蛋白质结合的DNA片段。另外，由于转录调节因子在细胞中的表达水平很低，利用常规的纯化方法很难获得足以进行氨基酸序列分析或抗体制备的纯化蛋白质，目前已克隆的转录因子不多，对这些因子的表达模式和DNA-蛋白质相互作用规律尚缺乏足够的研究。因此，当前转录

全文目录


中文摘要  7-10
英文摘要  10-14
一.前言  14-22
  1.信息传递和调控  14-16
  2.功能基因组研究  16-17
  3.DNA与蛋白质之间的相互作用和转录调节  17-19
  4.DNA调节元件和DNA结合蛋白筛选、鉴定  19-20
  5.本实验室以前的工作和本论文的基本内容  20-22
二.材料与方法  22-49
  (一) 实验材料  22-27
    1.菌株与细胞系  22
    2.质粒载体  22-25
    3.培养基  25
    4.限制性内切酶及修饰酶  25
    5.寡核苷酸  25
    6.试剂盒  25
    7.放射性核素  25
    8.其它主要试剂  25
    9.cDNA文库  25
    10.主要仪器设备  25-26
    11.溶液配制  26-27
  (二) 实验方法  27-49
    1.实验基本技术路线图  27-28
    2.人apoA_1C_3A_4基因簇的BAC DNA制备、纯化与酶切回收  28-29
      2.1 BAC DNA的大量制备  28-29
      2.2 BAC DNA的超离纯化  29
      2.3 脉冲场凝胶电泳(PFGE)回收纯化酶切片段  29
    3.BAC小片段探针的制备  29-32
      3.1 超声打断BAC大片段DNA  29-30
      3.2 小片段DNA的削平与补平  30
      3.3 DNA片段的纯化  30
      3.4 Oligo E的磷酸化和DNA连接子的形成  30
      3.5 连接反应  30-31
      3.6 PCR扩增  31
      3.7 第一轮凝胶阻滞实验用的人BAC DNA探针的制备  31-32
    4.细胞核粗提物的制备  32-33
      4.1 细胞复苏与培养  32
      4.2 细胞冻存  32
      4.3 核粗提物的制备  32-33
      4.4 蛋白定量  33
    5.多轮聚丙烯酰胺凝胶阻滞法富集调节片段  33-34
      5.1 EMSA  33
      5.2 DNA探针与hepG2细胞核粗提物的第二至五轮EMSA实验  33-34
      5.3 富集后调节片段的PCR大量扩增与回收纯化  34
    6.DNA调节片段质粒文库的构建  34-36
      6.1 调节片段的酶切消化  34-35
      6.2 质粒PUC19的限制性消化  35
      6.3 载体DNA的去磷酸化处理  35
      6.4 富含调节元件的人BAC DNA与PUC19载体DNA的连接  35-36
      6.5 自身连接产物和目的片段多拷贝插入的连接产物的去除  36
      6.6 DH5a感受态细胞的制备与转化  36
    7.DNA调节片段的EMSA筛选  36-38
      7.1 单菌落的培养、菌种保存和质粒DNA的小量制备  36-37
      7.2 质粒DNA的酶切鉴定  37
      7.3 插入调节片段的回收  37
      7.4 调节片段的同位素标记  37
      7.5 调节片段的EMSA筛选  37-38
    8.DNA调节片段的初步分析  38
      8.1 DNA调节片段的测序  38
      8.2 BLAST同源性分析  38
      8.3 DNA上潜在反式作用因子结合位点的分析  38
    9.荧光素酶报告基因真核表达质粒的瞬时表达及其酶活性的测定  38-41
      9.1 调节片段-荧光素酶报告基因重组质粒的构建  38-40
      9.2 重组质粒的鉴定和纯化  40
      9.3 Lipofectamine 2000法转染真核细胞  40-41
      9.4 转染细胞的裂解  41
      9.5 荧光强度的检测  41
      9.6 用分光光度法测定β-半乳糖苷酶活性  41
    10.利用酵母单杂交体系筛选DNA结合蛋白  41-49
      10.1 质粒文库滴度的测定  41-42
      10.2 质粒文库的扩增  42
      10.3 酵母菌株的表型验证、保存及培养  42-43
      10.4 制备酵母感受态细胞  43
      10.5 调节片段-His报告基因重组质粒的构建与鉴定  43-45
      10.6 报告基因载体整合到酵母基因组中  45-46
      10.7 整合有靶序列-His报告基因重组体的菌株的背景表达检测  46
      10.8 cDNA文库的转化及克隆筛选  46-48
      10.9 阳性克隆插入片段序列的PCR扩增鉴定  48
      10.10 阳性克隆插入片段的序列测定  48
      10.11 核酸序列的计算机分析  48-49
三.实验结果  49-77
  (一) 人apoA_1C_3A_4基因簇BAC DNA小片段探针制备与调节片段富集  49-51
    1 脉冲场凝胶电泳(PFGE)回收纯化BAC DNA酶切片段  49
    2 超声打断BAC大片段DNA  49
    3 PCR扩增与切胶回收  49-51
    4 DNA探针与hepG2细胞核粗提物的五轮凝胶阻滞实验  51
  (二) DNA调节片段的EMSA筛选与初步分析  51-61
    1 质粒DNA的酶切鉴定  51-52
    2 插入片段的EMSA筛选  52-54
    3 DNA调节片段的测序  54-57
    4 BLAST同源性分析  57-58
    5 DNA上潜在反式作用因子结合位点的分析  58-61
  (三) 荧光素酶报告基因重组质粒的瞬时表达  61-67
    1 重组质粒的酶切鉴定  61
    2 BAC调节片段转染hepG2细胞的检测结果  61-63
    3 人基因组调节片段转染K562细胞的检测结果  63-64
    4 人基因组调节片段转染hepG2细胞的检测结果  64-67
  (四) 利用酵母单杂交体系进行cDNA文库筛选  67-77
    1 重组质粒的酶切鉴定  67
    2 将靶DNA序列-报告基因质粒整合到酵母菌株基因组中  67-68
    3 靶DNA序列-报告基因菌株背景表达的检测  68-69
    4 人肝MATCHMAKER cDNA文库的滴度测定和扩增  69-70
    5 利用报告基因菌株对人肝cDNA文库进行筛选  70
    6 相同克隆的排除与假阳性克隆的排除  70-71
    7 阳性克隆质粒的插入片段序列测定及同源性比较分析  71-77
四.讨论  77-85
  (一) EMSA筛选与一般分析的讨论  77-79
    1.利用凝胶阻滞实验筛选DNA调节片段的的基本原理  77
    2.本研究的基本结果与本方法的基本特点  77-78
    3.已定位的序列  78
    4.本筛选结果的不足之处与改进  78-79
  (二) 瞬时转染结果讨论  79-80
    1.本部分基本结果分析  79-80
    2.E25片段分析  80
    3.本方法局限性与改进措施  80
  (三) 酵母单杂交结果讨论  80-82
    1.酵母单杂交系统工作原理  81
    2.本部分基本结果  81-82
    3.本方法局限性与改进措施  82
  (四) 本方法综合分析与展望  82-85
    1.非编码序列与功能基因组研究  82-83
    2.本方法与基因调控信息传递网络  83-85
五.小结  85-86
六.参考文献  86-92
七.综述  92-108
  (一) 基因组的进化与调控  92-99
  (二) 功能基因组研究中的网络模型构建  99-108
八.英文名词及缩写  108-112
九 致谢  112-113
十 个人简历  113

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 分子遗传学
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