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胺解改性含酯基聚合物生物材料及其细胞相容性研究

作　者: 竺亚斌
导　师: 沈家骢；高长有
学　校: 浙江大学
专　业: 高分子化学与物理
关键词: 聚合物生物材料胺解层层自组装细胞相容性组织工程内皮细胞
分类号: R318.08
类　型: 博士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

本文的目的在于研究与开发新型实用的聚合物生物材料表面改性技术,以构建细胞相容的生物材料表面和界面。本文首先在仔细分析和了解含酯基聚合物材料分子结构的基础上,首次将经典的-NH₂与-COO-的反应运用到表面改性生物可降解的含酯基的聚合物材料,运用二元胺对聚乳酸（PLLA）、聚己内酯（PCL）和聚氨酯（PU）等含酯基聚合物进行胺解改性,并研究了改性前后材料表面的物理和化学性能的变化。采用反应性荧光探针—异硫氰酸酯罗丹明和胺基指示剂—茚三酮对引入到材料表面的胺基密度进行了定性分析和定量计算。对于1,6-己二胺胺解PCL平面膜的体系,胺基主要存在于PCL膜表面（～30μm）,且胺基密度最大可达～2x10^-7mol/cm²。表面胺基密度可通过调节胺解反应条件予以控制。胺基的引入在一定程度上提高了材料表面的内皮细胞相容性,但胺基密度的大小对材料表面内皮细胞相容性的提高程度没有直接的关系。由于材料表面所含的胺基不足以完全覆盖基材,因此胺解改性后的生物材料其表面细胞相容性受基材的本体性能所影响,在所研究的三种含酯基聚合物材料（PLLA、PCL及PU）中,以胺解PLLA的内皮细胞相容性为最佳。自由胺基的引入不仅改善了材料表面的细胞相容性,更为重要的是提供了让基材进一步反应的活性位点,本文利用戊二醛在胺解的聚乳酸、聚己内酯和聚氨酯表面进一步固定了生物分子——明胶、壳聚糖和胶原,动态接触角（包括前进角和后退角）和静态接触角（包括Sessile drop和Captive bubble法）测试证明在材料表面固定生物大分子后,其亲水性得到明显改善:细胞培养及内皮功能测试结果证明这些生物分子在固定到上述材料表面后仍然保持其原有的生物活性,可明显促进内皮细胞的生长和分化,而与基材的本体性能无关。本文利用胺解反应在材料表面引入的自由胺基,首次将静电吸引层层自组装（Layer-by-layer）的技术引入到生物可降解材料的表面改性中。为了研究这一技术的可行性,文中以胺解的PLLA为例,首先采用较简单的带负电聚电解质聚苯乙烯磺酸钠（PSS）和具生物相容性的壳聚糖对PLLA进行自组装改性,并利用反应性荧光探针标记、紫外—可见吸收光谱、荧光能量转移及表面动态接触角测试等技术对自组装过程进行跟踪和检测。组装层的厚度开始随组装层数的增加而线性增加,而后增加变缓:扫描力显微镜（SFM）观察组装层表面形貌,发现组装层数少时组装层不能完全覆盖基底。体外细胞培养技术证明表面组装3双层PSS和壳聚糖（以壳聚糖为外层分子）以后,材料表面的内皮细胞相容性得到明显改善。

全文目录

中文摘要  9-12
英文摘要(Abstract)  12-16
第一章绪论  16-53
  §1.1 组织工程概述  16-18
  §1.2 聚合物生物材料  18-21
    1.2.1 脂肪族聚酯  19-20
    1.2.2 医用聚氨酯PU  20
    1.2.3 聚氨基酸  20
    1.2.4 医用硅橡胶  20-21
    1.2.5 聚甲基丙烯酸羟乙酯(PHEMA)  21
  §1.3 生物材料的细胞相容性  21-31
    1.3.1 细胞在生物材料表面的粘附机理  22-23
    1.3.2 蛋白质分子在生物材料表面的吸附行为  23-25
    1.3.3 细胞相容性的影响因素  25-31
      1.3.3.1 材料表面物理形貌对细胞相容性的影响  25-26
      1.3.3.2 材料表面亲疏水性对细胞相容性的影响  26-27
      1.3.3.3 材料表面能对细胞相容性的影响  27-28
      1.3.3.4 材料表面电荷对细胞相容性的影响  28-29
      1.3.3.5 材料表面化学官能团和生物活性因子对细胞相容性的影响  29-30
      1.3.3.6 材料表面的微图案化对细胞相容性的影响  30-31
  §1.4 生物材料的表面改性  31-42
    1.4.1 物理涂层或吸附  32-33
    1.4.2 等离子体、辉光放电和电晕放电  33-34
    1.4.3 表面接枝聚合  34-38
      1.4.3.1 氧化引入过氧基团  34-36
      1.4.3.2 等离子体引发表面接枝聚合  36-37
      1.4.3.3 辐射、电子束、激光、紫外光引发接枝聚合  37-38
      1.4.3.4 其他方法引发的表面接枝聚合  38
    1.4.4 化学气相沉积技术  38-39
    1.4.5 离子束注入技术  39
    1.4.6 表面腐蚀或其它化学反应  39-40
    1.4.7 材料表面的分子自组装修饰  40-42
  §1.5 内皮细胞及血管组织工程  42-51
    1.5.1 内皮细胞  42-43
    1.5.2 血管内皮细胞的功能  43-44
    1.5.3 生物材料表面的内皮细胞组织工程化  44-50
      1.5.3.1 用于血管组织工程的材料  44-46
      1.5.3.2 生物材料的血管组织工程化  46-48
      1.5.3.3 聚合物生物材料表面促细胞生长因子的固定方法  48-50
        1.5.3.3.1 生长因子涂层  48
        1.5.3.3.2 蛋白质和多肽涂层  48-49
        1.5.3.3.3 等离子体处理  49
        1.5.3.3.4 重组水蛭素(rHir)  49
        1.5.3.3.5 光学涂层  49-50
        1.5.3.3.6 肝素  50
    1.5.4 血管组织工程材料的发展趋势  50-51
  §1.6 课题的提出  51-53
第二章胺解与生物大分子固定改性含醋基聚合物生物材料  53-71
  §2.1 胺解与生物大分子固定改性聚已内醋(PCL)  53-63
    2.1.1 实验部分  54-56
      2.1.1.1 主要原材料和试剂  54
      2.1.1.2 胺解PCL膜的制备  54-55
      2.1.1.3 生物大分子在胺解PCL表面的固定  55
      2.1.1.4 胺解膜表面胺基的定性和定量分析  55-56
      2.1.1.5 测试与表征  56
    2.1.2 结果与讨论  56-63
      2.1.2.1 反应条件对胺解反应的影响  57-60
        2.1.2.1.1 PCL膜表面胺基密度的定性分析--RBITC荧光法  57-58
        2.1.2.1.2 PCL膜表面胺基密度的定量分析--茚三酮分析法  58-60
      2.1.2.2 改性PCL膜的光电子能谱(XPS)分析  60-61
      2.1.2.3 红外光谱分析(FTIR)  61-62
      2.1.2.4 改性PCL膜的表面亲水性  62-63
  §2.2 胺解与生物大分子固定在其它含酯基生物材料上的运用  63-69
    2.2.1 聚(L-乳酸)PLLA  63-66
      2.2.1.1 反应条件对PLLA胺解反应的影响  63-64
      2.2.1.2 红外光谱分析(FTIR)  64-65
      2.2.1.3 改性PLLA膜的表面亲水性  65-66
    2.2.2 聚氨酯PU  66-69
      2.2.2.1 反应条件对PU胺解反应的影响  66-68
      2.2.2.2 改性PU膜的表面亲水性  68-69
  §2.3 本章小结  69-71
第三章胺解与层层自组装方法改性含酯基聚合物材料  71-82
  §3.1 实验部分  72-73
    3.1.1 本章所用的主要原材料和试剂  72-73
    3.1.2 胺解PLLA膜的制备  73
    3.1.3 胺解PLLA表面上PSS／壳聚糖多层膜的制备  73
    3.1.4 荧光能量转移的测试  73
    3.1.5 测试与表征  73
  §3.2 结果与讨论  73-78
    3.2.1 紫外一可见吸收光谱  74
    3.2.2 动态接触角  74-75
    3.2.3 材料表面形貌  75-77
    3.2.4 荧光能量转移  77-78
  §3.3 用硫酸软骨素(Cs)和胶原改性PLLA  78-80
  §3.4 本章小结  80-82
第四章改性聚酯型生物材料的内皮细胞相容性研究  82-111
  §4.1 内皮细胞培养与细胞相容性表征方法  83-87
    4.1.1 原料与试剂准备  83-84
    4.1.2 改性膜的灭菌处理  84
    4.1.3 内皮细胞的培养方法  84
    4.1.4 细胞相容性表征方法  84-87
      4.1.4.1 细胞粘附率的测定  84-85
      4.1.4.2 细胞增殖率的测定  85
      4.1.4.3 细胞活性的测定  85
      4.1.4.4 细胞形态的观察—固定和染色  85
      4.1.4.5 内皮细胞的功能测试  85-87
  §4.2 改性后材料表面的内皮细胞相容性  87-103
    4.2.1 胺解与生物大分子固定的生物材料的细胞相容性  87-98
      4.2.1.1 PCL  87-90
      4.2.1.2 PLLA  90-93
      4.2.1.3 聚合物基材对细胞相容性的影响  93-98
    4.2.2 胺解与层层白组装(LBL)改性的生物材料的细胞相容性  98-103
      4.2.2.1 PSS／壳聚糖改性PLLA平面膜的细胞相容性  99-101
      4.2.2.2 硫酸软骨素／胶原多层膜改性PLLA的内皮细胞相容性  101-103
  §4.3 不同方法改性PLLA的内皮细胞相容性  103-109
  §5.3 本章小结  109-111
第五章 PU人工血管的改性及内皮细胞组织工程化  111-119
  §5.1 实验部分  112-113
    5.1.1 PU平面膜的制备及表面改性  112-113
    5.1.2 管状PU的内腔表面改性  113
    5.1.3 改性前后PU平面膜及PU人工血管的细胞培养  113
  §5.2 结果与讨论  113-117
    5.2.1 PU平面膜的内皮细胞相容性  113-115
    5.2.2 PU人工血管的内皮细胞组织工程化  115-117
  §5.3 本章小结  117-119
第六章静电吸引层层自组装技术改性PLLA多孔支架及其软骨细胞相容性  119-130
  §6.1 实验部分  120-123
    6.1.1 PLLA 多孔支架的制备及改性  120-121
    6.1.2 软骨细胞培养  121-123
      6.1.2.1 试剂和原料  121
      6.1.2.2 软骨细胞分离及培养  121-122
      6.1.2.3 PLLA平面膜和多孔支架上接种软骨细胞  122-123
      6.1.2.4 软骨细胞相容性的表征  123
  §6.2 结果与讨论  123-127
    6.2.1 PLLA平面膜的软骨细胞相容性  123-126
    6.2.2 PLLA多孔支架的软骨细胞相容性  126-127
  §6.3 对组织工程的一些思考  127-128
  §6.4 本章小结  128-130
全文结论  130-132
参考文献  132-155
作者简介  155-158
致谢  158

胺解改性含酯基聚合物生物材料及其细胞相容性研究

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