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新型树形高分子和聚磷酰胺基因传递载体的研究

作　者: 章雪睛
导　师: 卓仁禧；毛海泉
学　校: 武汉大学
专　业: 高分子化学与物理
关键词: 基因治疗 基因传递 聚合物载体 聚酰胺-胺树形高分子 聚磷酰胺(PPA) 肝靶向基因载体 去唾液酸糖蛋白受体 半乳糖化 三元纳米微粒 门静脉注射 胆管注射 含有咪唑基团的PPA 溶酶体 缓冲能力
分类号: R346
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要


基因治疗是一种为病人体细胞提供所需的基因物质,使其能够产生纠正或调节疾病的特异性蛋白的方法。近年来,越来越多的基因治疗研究已经在基础研究和临床研究方面取得巨大的进展。这些研究进展使基因治疗有希望成为治疗遗传或后天疾病（如心血管病和癌症等）的有效手段。 自从科学家成功完成人类基因组序列图后,基因治疗从治疗基因的克隆研究转移到了基因传递的研究。在基因治疗领域中,基因传递系统被用来将编码治疗蛋白序列的外源DNA引入到靶向细胞内,使之得到有效表达。目前已经发展了几种基因传递系统来促进体外或体内的基因表达。其中,病毒载体转染效率高,被用于首例人类基因治疗实验。然而,病毒载体的安全隐患（包括免疫原反应以及病毒自我复制的风险）和复杂昂贵的制备过程都限制了病毒载体的使用。这些不足促使人们致力于发展非病毒基因传递系统,如阳离子脂质体,聚合物及其它机械或电子相关的基因传递系统。在非病毒基因传递系统中,新型的生物相容的高分子基因载体得到了越来越多的关注。 尽管高分子基因载体在安全,免疫原反应和突变方面优越于病毒载体,但通常高分子基因载体的细胞毒性较高,转染效率较低。高分子载体用于基因治疗的主要限制因素在于不能有效的介导质粒DNA在细胞内进行传递（质粒DNA逃逸出内涵体,传递到细胞质,并进入细胞核进行表达）。因此,第一章探索了质粒DNA在细胞内、外的传递过程中所遇到的一系列障碍,并详细介绍了针对细胞内、外的传递障碍,新型高分子基因传递系统的设计以及最近所取得的进展,最后指出设计更加安全有效的高分子基因载体的新方向。 聚酰胺-胺（PAMAM）树形高分子是一类高度分枝的单分散性高分子,呈纳米尺寸的球状,表面带有很多伯氨基团。1993年Haensler等人首次将聚酰胺-胺树形高分子用作基因传递载体,在大量的悬浮或贴壁的哺乳动物细胞中介导了高效的基因转染。它们具有有利的pKa值,化学结构可以精确控制,毒性较低,因此大量研究使用树形高分子考察新的分子设计与体内外转染效率的联系。在第2章中,我们合成了从第1代到第8代以间苯三甲酸为核的聚酰胺-胺树型分子（G1～G8）,并考察了树型分子的核以及代数对树型分子/DNA复合物的形成和转染效率的影响.G1～G8的化学结构使用红外（F7-IR）,核磁共振（H NMR）和凝胶渗透色谱（GPC）进行表征。使用凝胶电泳和溴化乙啶置换实验考察G4～G8各代树型分子与DNA的复合能力.结果表明这5种树型分子在N/P比大于或等于1时能够完全阻止DNA在琼脂糖凝胶上的电场迁移。使用MTT方法评价它们在HeLa细胞中的细胞毒性。结果表明树型分子的细胞毒性随树型分子代数的增加而增加。G4～G8各代树形高分子的半致死浓度(LD50)分别为628,236,79,82和77μg/ml,高于广泛使用的聚乙烯亚胺（PEI）和聚赖氨酸（PLL）。光散射结果显示G6,G7和G8能紧密缩合DNA形成直径约为100～300nm的复合物,而G4和G5和DNA形成粒径很大的聚集体。考察了G4～G8各代树形高分子在HeLa,COS7和大鼠原代肝细胞中的转染效率。树形高分子介导的转染效率高低依次为G6>G7>G8>G5>G4。G6的转染效率最高,与PEI相等。使用酸碱滴定方法发现G6在pH5.5～6.4 范围内具有较高的缓冲能力（pKa≈6）,而且 Bafi lomycin A1能

全文目录


中文摘要  4-8
英文摘要  8-12
目录  12-17
第一章 高分子基因传递载体的研究进展  17-47
  1 引言  17-18
  2 阳离子高分子基因传递系统  18-28
    2.1 阳离子高分子载体／DNA复合物进行基因传递的一般过程  18-19
    2.2 用于基因传递的阳离子高分子载体  19-26
      2.2.1 聚赖氨酸  20
      2.2.2 聚乙烯亚胺(polyethyleneimine，PEI)  20-21
      2.2.3 脱乙酰壳多糖(chitosan)  21-22
      2.2.4 树形高分子(dendrimer)  22-24
      2.2.5 阳离子聚磷酸酯(polyphosphoester)和聚磷酰胺(polyphosphoramidate)  24-25
      2.2.6 其他阳离子高分子  25-26
    2.3 含有多功能组分的聚阳离子基因传递系统  26-28
      2.3.1 含有靶向性组分的高分子基因传递系统  26-27
      2.3.2 含有内涵体(endosome)破膜组分的高分子基因传递系统  27
      2.3.3 含有核定位传导信号组分的高分子基因传递系统  27-28
  3 温度敏感的聚合物基因传递系统  28
  4 聚合物胶束基因传递系统  28-29
  5 非离子高分子基因传递系统  29
  6 其它  29
  7 结论  29-30
  参考文献  30-47
第二章 以间苯三甲酸为核的三方向聚酰胺一胺树形高分子作为基因传递载体的研究  47-69
  1 引言  47-48
  2 实验部分  48-50
    2.1 材料和方法  48
    2.2 聚酰胺-胺树形高分子的合成  48
    2.3 大鼠元代肝细胞的分离及培养  48-49
    2.4 质粒DNA的分离和纯化  49
    2.5 凝胶电泳  49
    2.6 溴化乙啶置换  49
    2.7 G4～G8／pVR1255复合物粒径和zeta电位测定  49
    2.8 聚酰胺-胺树形分子G4～G8的细胞毒性  49-50
    2.9 聚酰胺-胺树形分子G4～G8介导外源基因DNA转染体外细胞  50
    2.10 聚酰胺-胺树形分子G6的酸碱滴定  50
  3 结果与讨论  50-64
    3.1 三方向核聚酰胺-胺树形高分子G1～G8的合成和表征  50-54
    3.2 G4～G8的体外(in vitro)细胞毒性  54
    3.3 G4～G8与质粒DNA的相互作用  54-58
      3.3.1 凝胶电泳  54-56
      3.3.2 溴化乙啶置换实验  56
      3.3.3 G4～G8／pDNA复合物的粒径  56-58
      3.3.4 G4～G8／pDNA复合物的zeta电位  58
    3.4 聚酰胺-胺树形高分子G4～G8介导外源DNA转染细胞  58-63
      3.4.1 G4～G8／pDNA复合物转染细胞  58-60
      3.4.2 血清对G6／pDNA复合物转染细胞的影响  60-61
      3.4.3 氯喹和Bafilomycin A1对G6／pDNA复合物转染细胞的影响  61-63
    3.5 本章主要结论  63-64
  参考文献  64-69
第三章 聚磷酰胺基因传递载体的研究一侧链结构影响其转染效率  69-89
  1 引言  69-70
  2 实验部分  70-73
    2.1 材料和方法  70
    2.2 PPA载体的合成  70-71
    2.3 荧光胺分析法定量PPA载体的伯氨基数  71
    2.4 大鼠元代干细胞的分离及培养  71
    2.5 PPA载体的体外细胞毒性  71-72
    2.6 PPA／DNA复合物的制备和凝胶电泳  72
    2.7 PPA／pVR1255复合物粒径和zeta电位测定  72
    2.8 PPA载体介导外源基因DNA转染体外细胞  72
    2.9 PPA载体介导的体内转染实验  72-73
      2.9.1 PPA-EA和PPA-DEA增强pVR1255基因在小鼠后腿胫骨前肌中的表达  73
      2.9.2 PPA-DEA通过胆管注射途径介导pVR1255转染大鼠肝脏  73
  3 结果与讨论  73-85
    3.1 聚磷酰胺的合成及表征  73-77
    3.2 PPA的细胞毒性  77-78
    3.3 PPA与质粒DNA的相互作用  78-80
      3.3.1 凝胶电泳  78-79
      3.3.2 PPA／DNA复合物的粒径和zeta电位  79-80
    3.4 PPA／DNA复合物介导的体外细胞转染  80-82
    3.5 PPA／DNA复合物介导pVR1255在小鼠肌肉中的表达  82-83
    3.6 PPA／DNA复合物介导pVR1255在大鼠肝脏中的表达  83-84
    3.7 本章主要结论  84-85
  参考文献  85-89
第四章 肝靶向聚磷酰胺基因载体一半乳糖化PPA／DNA三元复合物增强DNA在肝细胞中的表达  89-113
  1 引言  89
  2 实验部分  89-92
    2.1 材料和方法  90
    2.2 Gal-PPA和Gal-PPA的合成  90
    2.3 PPA-DEA和4％Gal-PPA-DEA在肌肉中的组织反应  90
    2.4 Gal-PPA与RCA120的结合能力  90-91
    2.5 Gal-PPA／PPA／pVR1255三元复合物的制备以及Dextran sulfate置换  91
    2.6 4％Gal-PPA-DEA／PPA／[35S]pVR1255三元复合物在HepG2细胞中的细胞摄取  91
    2.7 4％Gal-PPA-DEA通过门静脉注射增强pVR1255在小鼠肝中的表达  91-92
  3 结果与讨论  92-110
    3.1 Gal-PPA和Man-PPA的合成及表征  92-93
    3.2 凝胶电泳—PPA载体的半乳糖基取代程度对PPA载体与DNA相互作用的影响  93-94
    3.3 Gal-PPA的体外细胞毒性  94-96
    3.4 PPA-DEA和4％Gal-PPA-DEA在肌肉中的组织反应  96
    3.5 Gal-PPA／DNA复合物对RCA120的亲和性  96-100
    3.6 Gal-PPA-DPA／DNA二元复合物介导VR1255在HepG2细胞中的基因表达  100
    3.7 Gal-PPA-DPA／DNA二元复合物和Gal-PPA-DPA／PPA／DNA三元复合物的稳定性  100-102
    3.8 Gal-PPA-DPA与DNA形成的二元复合物或三元复合物的粒径及Zeta电位  102-104
    3.9 4％Gal-PPA-DEA／PPA／[35S]pVR1255三元复合物在HepG2细胞中的细胞吸收  104-105
    3.10 Gal-PPA／PPA／pVRl255三元复合物靶向性转染肝细胞  105-108
      3.10.1 Gal-PPA选择性增强PPA载体介导pVR1255转染HepG2细胞的效率  105-107
      3.10.2 Gal-PPA-DPA半乳糖含量对大鼠元代肝细胞转染效率的影响  107-108
    3.11 Gal-PPA-DEA增强荧光素酶基因在小鼠肝脏中的表达  108-109
    3.12 本章主要结论  109-110
  参考文献  110-113
第五章 Galactose-PEG-PPA的合成及其作为肝靶向基因载体的研究  113-131
  1 引言  113
  2 实验部分  113-114
    2.1 实验和方法  113-114
    2.2 2％Gal-PEG-PPA的合成  114
    2.3 PPA载体通过胆管注射途径介导基因传递  114
  3 结果与讨论  114-127
    3.1 Gal-PEG-PPA的合成与表征  115-116
    3.2 2％Gal-PEG-PPA的体外细胞毒性  116
    3.3 PPA-DEA和2％Gal-PEG-PPA在小鼠肌肉中的组织反应  116-119
    3.4 PPA载体与DNA的相互作用-凝胶电泳，复合物粒径和Zeta电位  119-120
    3.5 2％Gal-PEG-PPA／PPA／pVR1255三元复合物对RCA120的亲和性  120-121
    3.6 2％Gal-PEG-PPA／PPA／[~35S]pVR1255三元复合物在HepG2细胞中的细胞摄取  121-122
    3.7 2％Gal-PEG-PPA介导pVRl255靶向转染肝细胞  122-124
      3.7.1 2％Gal-PEG-PPA选择性增强pVR1255在HepG2细胞中的表达  122-123
      3.7.2 血清对2％Gal-PEG-PPA介导pVR1255转染hepatocytes的影响  123-124
    3.8 2％Gal-PEG-PPA介导pVR1255进行体内基因传递  124-126
    3.9 本章主要结论  126-127
  参考文献  127-131
第六章 含有咪唑基团的聚磷酰胺(咪唑PPA结合体)的设计合成及其作为基因载体的研究  131-145
  1 引言  131
  2 实验部分  131-132
    2.1 材料和方法  131-132
    2.2 咪唑-PPA结合体的合成  132
      2.2.1 HEA的合成  132
      2.2.2 EA-co-His，DEA-co-His和PPA-His的合成  132
    2.3 酸碱滴定  132
  3 结果与讨论  132-143
    3.1 咪唑-PPA结合体的分子设计  132-133
    3.2 咪唑-PPA结合体的合成与表征  133-136
    3.3 酸碱滴定分析  136-138
    3.4 咪唑基团的引入降低PPA的细胞毒性  138
    3.5 咪唑-PPA结合体与质粒DNA的相互作用  138-142
      3.5.1 凝胶电泳  138-140
      3.5.2 咪唑-PPA结合体／pVR1255复合物的粒径和zeta电位  140-141
      3.5.3 咪唑-PPA结合体所带正电荷的理论计算  141-142
    3.6 咪唑-PPA结合体介导pVR1255进行体外细胞转染  142-143
    3.7 本章主要结论  143
  参考文献  143-145
论文总结  145-147
附录 作者在攻读博士学位期间已发表和待发表的论文  147-149
致谢  149

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体生物化学、分子生物学
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