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长角血蜱卵黄发生及其激素调控

作　者: 杨小龙
导　师: 刘敬泽
学　校: 河北师范大学
专　业: 动物学
关键词: 长角血蜱卵黄发生卵黄蛋白卵黄原蛋白脂肪体血淋巴卵巢保幼激素保幼激素类似物蜕皮激素激素调控
分类号: Q969.91
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

蜱类是专性吸血的外寄生动物,传播多种人、畜疾病且具极强的繁殖力,对人类健康和畜牧业造成极大危害。蜱类生殖生理学是国际上研究的热点领域,其中卵黄发生及其调控是该领域的核心内容。本研究以广泛分布于我国的长角血蜱Haemaphysalis longicornis Neumann为研究对象,运用组织培养、生物化学、分析化学、免疫细胞化学、酶联免疫分析、气相色谱/质谱和质量肽谱等现代生物学及其交叉学科的研究方法,在纯化出长角血蜱Vn基础上,对Vn与Vg的理化性质、蛋白序列分析、Vg合成组织与合成细胞定位、Vg合成分泌动态以及两类不同性质激素的作用进行了系统研究,对于深入阐明蜱类卵黄发生及其调控机理,揭示蜱类生殖生物学规律、适应对策和生理调节机制具有重要的科学意义。长角血蜱Vn只有一种,是一种血糖脂复合蛋白,等电点为5.4,相对分子质量为370KD,由8个亚基组成,亚基相对分子质量分别为112KD、103KD、80KD、78KD、71KD、68KD、62KD和52KD。Vn亚基P1和P3的N-端序列测定表明,P1为N-端封闭,P3 N-端15个氨基酸顺序为YSVLPVYLPCFYEKC。本文首次将MALDI-TOF-MS技术应用于Vn蛋白序列的研究,获得8个Vn亚基的肽质量指纹图谱(PMF),将所得PMF数据在线进行比对,检索NCBI数据库。确定Vn各亚基为未被NCBI数据库所纪录的新蛋白。应用GC/MS技术鉴定Vn糖分与脂类,结果表明,Vn的主要糖分为甘露糖和葡萄糖,另含微量的鼠李糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、山梨糖、N-乙酰葡糖胺和N-乙酰半乳糖胺;Vn脂类的主要脂肪酸成分为(Z)-13-十八碳烯酸和十八烷酸,另含少量14-甲基十五烷酸和8,11-十八碳二烯酸。长角血蜱脂肪体由营养细胞构成,聚集细胞常伴随出现。在卵黄发生期,营养细胞含有大量与蛋白合成有关的细胞器。电泳结果显示,脂肪体蛋白具有多样性,成分复杂。饥饿期,脂肪体蛋白成分相对较少。吸血初期,蛋白成分有所增加,交配期无明显变化,饱血期蛋白成分增多。产卵初期,部分蛋白带消失。在雌蜱饱血后至产卵前阶段,脂肪体内蛋白成分最丰富。通过免疫印迹实验和免疫电镜观察,确证脂肪体是Vg的合成位点,中心区脂肪体与外周区脂肪体的营养细胞均合成Vg。雌蜱吸血后血淋巴蛋白成分逐渐增加,饱血期蛋白成分最多,产卵初期有所减少。

全文目录

缩略语  10-12
摘要  12-14
Abstract  14-18
第一章综述：蜱类卵黄发生研究进展  18-26
  1 蜱类的卵黄发生  18-22
    1.1 卵黄蛋白和卵黄原蛋白  19-20
    1.2 卵黄原蛋白的合成  20-21
    1.3 卵黄原蛋白的吸收  21-22
  2 蜱类卵黄发生的激素调控  22-25
    2.1 蜱类的激素  22-23
    2.2 软蜱  23-24
    2.3 硬蜱  24-25
  3 展望  25-26
第二章引言  26-28
第三章材料与方法  28-43
  1 长角血蜱的采集与喂养  28
  2 卵的收集与粗提  28
  3 卵黄蛋白的纯化  28-29
  4 卵黄蛋白等电点的测定  29
  5 卵黄蛋白的糖脂蛋白染色  29
  6 卵黄蛋白亚基N-端序列测定  29
  7 卵黄蛋白的双向电泳与MALDI-TOF-MS分析  29-34
  8 GC／MS法分析卵黄蛋白所含糖分  34
  9 GC／MS法分析卵黄蛋白脂类成分  34-35
  10 Vn多克隆抗体的制备  35-37
  11 免疫印迹(Western-Blot)  37-38
  12 间接竞争法ELISA  38
  13 卵黄原蛋白合成的免疫电镜细胞定位  38-39
  14 卵巢中可溶性蛋白含量测定  39
  15 电泳分析  39-40
  16 局部点滴与注射  40-41
  17 体外组织培养  41
  18 主要仪器设备  41-42
  19 主要试剂  42-43
第四章卵黄蛋白的纯化与理化性质分析  43-63
  1 前言  43-44
  2 材料与方法  44
  3 结果  44-58
    3.1 卵黄蛋白的提取与纯化  44-45
    3.2 卵黄蛋白是一种含血红素的糖脂蛋白  45-46
    3.3 卵黄蛋白的相对分子质量与亚基组成  46-47
    3.4 卵黄蛋白的等电点  47
    3.5 卵黄蛋白亚基N-端测序  47
    3.6 卵黄蛋白双向电泳  47-48
    3.7 卵黄蛋白双向电泳图谱的软件分析  48-49
    3.8 卵黄蛋白亚基MALDI-TOF-MS鉴定  49-50
    3.9 卵黄蛋白亚基鉴定结果  50-52
    3.10 卵黄蛋白糖分的GC／MS鉴定  52-55
    3.11 卵黄蛋白脂类的脂肪酸分析  55-58
  4 讨论  58-63
第五章卵黄原蛋白合成位点的免疫学研究  63-75
  1 前言  63-64
  2 材料与方法  64
  3 结果  64-71
    3.1 ELISA检测抗体效价  64
    3.2 免疫斑点法检测抗体特异性  64-65
    3.3 免疫印迹(Western-Blot)检测组织  65-66
    3.4 脂肪体和中肠的超微结构  66-69
    3.5 免疫胶体金电镜定位  69-71
  4 讨论  71-75
第六章卵黄原蛋白的合成与激素作用  75-86
  1 前言  75
  2 材料与方法  75-76
  3 结果  76-82
    3.1 不同发育期脂肪体蛋白成分的动态变化  76
    3.2 不同发育期血淋巴蛋白成分的动态变化  76-77
    3.3 卵黄原蛋白的鉴定  77-78
    3.4 不同发育期血淋巴中卵黄原蛋白含量的动态变化  78-80
    3.5 保幼激素Ⅲ对血淋巴中卵黄原蛋白含量的作用  80-81
    3.6 20-羟基蜕皮酮对血淋巴中卵黄原蛋白含量的作用  81-82
  4 讨论  82-86
第七章卵发育与激素作用  86-96
  1 前言  86
  2 材料与方法  86
  3 结果  86-92
    3.1 不同发育期卵巢蛋白含量的动态变化  86-88
    3.2 不同发育期卵巢蛋白成分的动态变化  88
    3.3 法尼醇对饱血雌蜱卵巢蛋白含量的影响  88-89
    3.4 法尼醇对饱血雌蜱卵巢蛋白成分的影响  89-90
    3.5 法尼醇对饱血雌蜱卵巢中卵黄蛋白含量的影响  90
    3.6 20-羟基蜕皮酮对饱血雌蜱卵巢蛋白含量的影响  90-91
    3.7 20-羟基蜕皮酮对饱血雌蜱卵巢中卵黄蛋白的影响  91-92
  4 讨论  92-96
第八章总结  96-98
参考文献  98-109
发表的论文  109-110
致谢  110-111
附录  111-114

长角血蜱卵黄发生及其激素调控

内容摘要

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