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原发性肾病综合征激素耐药机制探讨

作　者: 余自华
导　师: 陈新民；丁洁
学　校: 第一军医大学
专　业: 儿科学
关键词: 肾病综合征激素耐药 NPHS2 Podocin 中国人细胞表面表达 NR3C1 基因多态性单倍体
分类号: R726.91
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

第一部分家族性激素耐药型肾病综合征家系NPHS2基因的分析目的原发性肾病综合征(primary nephrotic syndrome,PNS)是儿童最常见的肾小球疾病,临床表现为大量蛋白尿、低蛋白血症、高胆固醇血症和不同程度的浮肿。大部分PNS患儿对激素敏感,预后良好;然而,10%～20%PNS患儿对激素耐药,大部分将逐渐进展到终末肾。近年来,关于肾病综合征(nephrotic syndrome,NS)激素耐药的发生机制研究在单基因突变引起激素耐药型肾病综合征(steroid-resistant nephrotic syndrome,SRNS)方面取得了突破性进展,如常染色体隐性遗传型SRNS由新近认识的NPHS2基因突变引起。NPHS2基因编码蛋白podocin是一个含有383个氨基酸的“发夹样”完整膜蛋白,第105～121位氨基酸为膜区,氨基端(第1～104位氨基酸)和羧基端(第122～383位氨基酸)均在细胞质中,定位在足细胞裂孔隔膜区,是维持肾小球正常滤过功能的关键分子之一。由NPHS2基因突变引起家族性SRNS在我国尚未见报道。中国汉族人家族性SRNS是否存在NPHS2基因突变及其特点均不清楚。本研究通过对一个中国汉族人家族性SRNS家系NPHS2基因突变的检测,旨在分析中国汉族人家族性SRNS家系NPHS2基因及其突变特点。方法研究对象为一个汉族人家族性SRNS家系中的先证者(9个月女孩)及其兄(9岁半死于

全文目录

摘要  3-11
ABSTRACT  11-27
前言  27-32
1 家族性激素耐药型肾病综合征家系NPHS2基因的分析  32-56
  1.1 实验材料  32-38
    1.1.1 研究对象  32
    1.1.2 标本收集  32-33
    1.1.3 引物设计  33-34
    1.1.4 主要仪器  34-35
    1.1.5 主要药品、试剂及其配制  35-38
  1.2 方法  38-45
    1.2.1 肾组织间接免疫荧光染色  38
    1.2.2 基因组DNA的提取与定量  38-39
    1.2.3 PCR扩增NPHS2基因8个外显子  39-40
    1.2.4 DHPLC分析  40-43
    1.2.5 DNA序列测定  43-45
  1.3 结果  45-50
    1.3.1 肾脏病理及常规免疫病理  45
    1.3.2 先证者肾组织中podocin、nephrin、alpha-actinin-4和WT1的表达  45
    1.3.3 琼脂糖凝胶电泳鉴定  45-46
    1.3.4 DHPLC检测条件的建立  46
    1.3.5 DHPLC分析结果  46
    1.3.6 DNA测序结果  46-50
  1.4 讨论  50-55
  1.5 小结  55-56
2 散发性激素耐药型肾病综合征患儿NPHS2基因的分析  56-80
  2.1 实验材料  56-61
    2.1.1 研究对象  56
    2.1.2 引物设计  56-57
    2.1.3 主要仪器  57
    2.1.4 主要药品、试剂及其配制  57-61
  2.2 方法  61-63
    2.2.1 基因组DNA的提取与定量  61
    2.2.2 PCR扩增NPHS2基因8个外显子  61
    2.2.3 DHPLC分析  61-62
    2.2.4 DNA序列测定  62
    2.2.5 统计学分析  62-63
  2.3 结果  63-73
    2.3.1 23例散发性SRNS患儿的临床资料  63
    2.3.2 DHPLC分析结果  63
    2.3.3 DNA测序结果  63-64
    2.3.4 基因型和等位基因频率  64-73
  2.4 讨论  73-79
  2.5 小结  79-80
3 突变NPHS2基因在真核细胞中的表达  80-116
  3.1 实验材料  80-86
    3.1.1 研究对象  80
    3.1.2 主要试剂及试剂盒  80-81
    3.1.3 主要仪器  81-82
    3.1.4 主要液体配制  82-86
  3.2 方法  86-101
    3.2.1 构建含有野生型NPHS2基因编码区全长cDNA的克隆载体  86-92
    3.2.2 分别构建含有NPHS2基因467_468insT突变cDNA和503G＞A突变cDNA的克隆载体  92-94
    3.2.3 分别构建含有野生型NPHS2基因cDNA、467_468insT突变cDNA和503G＞A突变cDNA的表达载体  94-95
    3.2.4 质粒DNA的大量制备  95-97
    3.2.5 转染HEK293细胞  97-99
    3.2.6 应用间接免疫荧光染色，用共聚焦显微镜观察podocin的荧光强度及其在细胞内的定位  99-101
  3.3 结果  101-109
    3.3.1 从正常肾组织中提取总RNA结果  101
    3.3.2 PCR扩增NPHS2基因编码区全长cDNA结果  101
    3.3.3 构建分别含有野生型NPHS2基因全长编码区cDNA、467_468insT突变cDNA和503G＞A突变cDNA的克隆载体结果  101
    3.3.4 构建分别含有野生型NPHS2基因全长编码区cDNA、467_468insT突变cDNA和503G＞A突变cDNA的表达载体结果  101
    3.3.5 大量制备质粒DNA结果  101-108
    3.3.6 HEK293细胞podocin免疫荧光双标记染色结果  108-109
  3.4 讨论  109-115
  3.5 小结  115-116
4 激素耐药型肾病综合征儿童糖皮质激素受体基因的检测和分析  116-136
  4.1 实验材料  116-119
    4.1.1 研究对象  116-117
    4.1.2 引物  117
    4.1.3 主要仪器  117
    4.1.4 主要药品、试剂及其配制  117-119
  4.2 方法  119-122
    4.2.1 基因组DNA的提取与定量  119
    4.2.2 分离外周血淋巴细胞  119
    4.2.3 从外周血淋巴细胞中提取总RNA  119-120
    4.2.4 PCR扩增NR3C1基因片段  120
    4.2.5 PCR扩增NR3C1基因alpha-cDNA、beta-cDNA和ACTB基因cDNA及RT-PCR产物的鉴定  120-121
    4.2.6 DHPLC分析  121
    4.2.7 DNA序列测定  121
    4.2.8 统计学分析  121-122
  4.3 结果  122-128
    4.3.1 NS患儿临床资料  122
    4.3.2 从外周血淋巴细胞提取总RNA  122
    4.3.3 RT-PCR结果  122
    4.3.4 DHPLC分析结果  122-123
    4.3.5 DNA测序结果  123
    4.3.6 NR3C1基因单倍体3和单倍体5的等位基因频率  123-128
  4.4 讨论  128-135
  4.5 小结  135-136
参考文献  136-149
附录  149-150
成果  150-152
综述  152-174
致谢  174-176
原创性声明及版权使用授权书  176

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