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人红细胞膜上以带3蛋白为核心的蛋白质复合体研究

作　者: 丁滪
导　师: 张志鸿
学　校: 复旦大学
专　业: 生物物理学
关键词: 人红细胞膜复合体蛋白质蛋白相互作用主要功能跨膜脂筏生物膜血红蛋白磷酸果糖激酶
分类号: Q51
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

带3蛋白（Band 3）是人红细胞膜上最主要的蛋白质,其基因位于第17号染色体的q21-q22区段。带3蛋白可分为结构和功能都明显差别的两部分:约50kDa的跨膜段（transmembrane domain of Band 3,tdb3）和约43kDa的胞质段（cytoplasmic domain of Band 3,cdb3）。带3蛋白跨膜段的主要功能是催化Cl^-和HCO3^-的跨膜交换;带3蛋白的胞质段能与多种胞内蛋白所结合,并形成以其为中心的红细胞膜蛋白复合体,其作用主要有以下几种: 1.与细胞骨架蛋白ankyrin、protein 4.1和protein 4.2等相互作用,是调控细胞膜和细胞骨架之间相互作用的重要元件; 2.与红细胞膜的内在整合膜蛋白相互作用,如Rh复合体、血型糖蛋白复合体、葡萄糖转运蛋白等,最近的研究发现在脂筏（lipid rafts）也存在着带3蛋白; 3.与糖酵解酶相互作用,并调控它们的活性,主要包括醛缩酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶和6-磷酸果糖激酶; 4.与还原型血红蛋白及与高铁血色原作用,带3蛋白与血红蛋白的作用还可能调控了细胞内一氧化氮的浓度,与高铁血色原的作用则形成以带3蛋白多聚体为核心的自身抗原: 5.带3蛋白还与碳酸酐酶Ⅱ等相互作用,并可能在红细胞膜上形成以带3蛋白为核心的CO₂/O₂气体交换中间体。带三蛋白的突变会引起多种疾病,如东南亚卵圆形细胞增多症（Southeast Asian ovalocytosis,SAO）、遗传性球形红细胞增多症（hereditary spherocytosis,HS）和远端肾小管酸中毒（distal renal tubular acidosis,dRTA）等。生物膜膜脂主要分为三类:甘油磷脂,鞘脂以及胆固醇,但对于鞘脂和胆固醇的研究则较少,而这两种膜脂是一种生物膜微区结构脂筏的主要组分。脂筏的蛋白质大多与信号转导相关,其特有的蛋白主要有三大类:caveolin、flotillin和stomatin。其中flotillin参与了胰岛素依赖型的葡萄糖代谢信号转导通路,该通路不依赖于PI（3）K,我们实验室以前的研究也证实了2型糖尿病人红细胞膜内的flotillin表达明显升高。带3蛋白是红细胞膜上最主要的蛋白,而flotillin是红细胞脂筏上最主要的蛋白,两者之间是否也存在着某种相互作用? 为了研究以带3蛋白为核心的膜蛋白复合体,我们首先建立了可靠的in vitro 实验系统。我们尝试通过基因克隆的方法,在大肠杆菌中大量表达重组的带3蛋白,但发觉全长带3蛋白的表达不佳,主要是其疏水的跨膜段表达不佳,而带3蛋白跨膜段的主要功能是阴离子交换,很少与其他蛋白相互作用,因此我们将重点转向克隆和表达cdb3。我们成功地表达了5种融合了不同接头的重组cdb3:

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-9
常用缩写  9-10
第一部分综述  10-45
  第一节人红细胞膜带3蛋白及以其为核心的复合体  10-38
  第二节 Flotillin蛋白的研究进展  38-45
第二部分材料和方法  45-62
  第一节材料、试剂、基本操作和仪器设备  45-50
  第二节实验方法和步骤  50-62
第三部分结果与讨论  62-97
  一、从人红细胞膜中提取带3蛋白和cdb3  62-63
  二、尝试在不同原核载体内克隆、表达全长带3蛋白  63-65
  三、克隆cdb3至不同原核表达载体  65-66
  四、重组cdb3蛋白表达条件的优化  66-67
  五、重组cdb3蛋白纯化条件的优化  67-71
  六、SDS-PAGE、Western blot比较和鉴定cdb3  71-73
  七、质谱法鉴定cdb3  73-75
  八、cdb3的pH依赖性内禀荧光  75-78
  九、Pull-down assay研究cdb3和protein 4.2的相互作用  78-81
  十、Pull-down assay研究cdb3和Ankyrin的相互作用  81-86
  十一、cdb3和红细胞膜蛋白间的相互作用的研究  86-93
  十二、初步研究带3蛋白和flotillin的相互作用  93-94
  十三、初步研究带3蛋白和arginase的相互作用  94-95
  十四、初步研究带3蛋白和G蛋白α亚基间的相互作用  95-96
  十五、动力学方法研究带3蛋白和GLUT1间的相互作用  96-97
第四部分总结和展望  97-104
参考文献  104-126
论文发表情况  126-127
附录：人带3蛋白的氨基酸序列  127-128
致谢  128-129
论文独创性声明  129
论文使用授权声明  129

人红细胞膜上以带3蛋白为核心的蛋白质复合体研究

内容摘要

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