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皮肤变态反应中P物质的调控机制及药物作用研究

作　者: 刘继勇
导　师: 胡晋红
学　校: 第二军医大学
专　业: 药理学
关键词: 皮肤变态反应:P物质神经激肽1受体角质形成细胞 HaCaT细胞真皮成纤维细胞白介素10 γ-干扰素单核细胞趋化蛋白1 盐酸西替利嗪苦参碱荆芥挥发油
分类号: R96
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

皮肤变态反应是发生率较高的过敏反应,当外界致敏原刺激机体时,往往首先在皮肤出现过敏症状,特别是对于需要常年在边防、海岛等恶劣环境下进行工作与生活的部队官兵,影响尤为严重。因此,深入探讨皮肤变态反应性疾病的发病机制,发现新的药物作用靶点和新的治疗药物,具有重要的科学价值与军事意义。近年来,免疫-神经-内分泌网络在皮肤病中的作用日益受到人们的重视。神经系统通过神经递质对皮肤细胞发生作用,具有调节皮肤生理和病理生理的功能。特异性的神经递质拮抗剂可以通过影响该网络的受体-配体结合和信息传递而介入疾病的病理过程,发挥相应的治疗作用。随着对变态发应性疾病在细胞和分子水平上研究的不断深入,探讨新的药物作用环节和开发新型治疗药物已成为变态反应研究领域的热点。 P物质(Substance P,SP)是速激肽家族成员,通过与其受体NK-1R结合,参与了皮肤变态反应的发病机制,与皮肤免疫与皮肤炎症密切相关。对于皮肤角质形成细胞、成纤维细胞等介导的皮肤免疫系统的研究,是目前国外皮肤科学研究的热点,但对于神经肽类物质,特别是SP及NK-1R在皮肤变态反应中的作用机制却少有系统报道,也未见相关的神经肽拮抗剂上市。因此,研究SP及其受体在皮肤变态反应中的作用机制,从神经生物学角度探讨变态反应性疾病的发病机理,将为该类疾病的治疗提供新的思路。相关神经肽拮抗剂的发现与研究也将为变态反应性疾病及某些与神经肽有关的皮肤病的治疗开辟新的前景。中医药对变态反应性疾病的治疗独具优势,能通过多途径作用实现抗过敏,且重视整体平衡,因而疗效好,副作用少,体现出明显的治疗优势和特色。因此,从传统中医药中寻找新的抗过敏药物愈来愈受到研究者的重视。本研究首先构建新型皮肤三相过敏反应动物模型,从整体水平探讨SP在过敏反应不同阶段的表达行为,并考察抗组胺药盐酸西替利嗪对过敏反应中SP表达的影响。体外培养人表皮角质形成细胞株HaCaT细胞和真皮成纤维细胞,应用免疫组化、RT-PCR方法考察NK-1R在两种细胞上的表达特征。采用流式细胞术和Western blotting等方法研究SP、LPS、IFN-γ等刺激因素对两种细胞NK-1R的表达调控及盐酸西替利嗪对这一靶点的作用。以SP处理HaCaT细胞和真皮成纤维细胞,考察盐酸西替利嗪对细胞分泌细胞因子IFN-γ、IL-10和趋化因子MCP-1的影响。在本室前期研究基础上筛选出具有抗过敏活性的中药苦参、荆芥,考察其有效部位苦参碱、荆芥挥发油对皮肤变态反应中

全文目录

缩略词表  7-9
中文摘要  9-14
英文摘要  14-19
前言  19-23
第一部分小鼠皮肤三相过敏反应动物模型的建立  23-32
  1 实验材料  23-25
  2 实验方法  25-26
    2.1 小鼠耳皮肤过敏反应的诱导及anti-DNP IgE单克隆抗体浓度的筛选  25
    2.2 小鼠皮肤三相过敏模型的建立  25
    2.3 组织病理学检测  25-26
    2.4 血清IgE水平的测定  26
    2.5 统计分析  26
  3 结果  26-29
    3.1 anti-DNP IgE单克隆抗体浓度的确定  26-27
    3.2 IgE诱导的小鼠皮肤三相过敏反应模型的建立  27-28
    3.3 小鼠耳皮肤组织病理观察  28
    3.4 血清IgE水平测定结果  28-29
  4 讨论  29-32
第二部分 P物质在皮肤三相过敏反应中的表达及药物的调控作用  32-39
  1 实验材料  32-33
  2 实验方法  33-34
    2.1 P物质在小鼠皮肤三相过敏反应中的表达  33-34
    2.2 盐酸西替利嗪对小鼠皮肤三相过敏反应的作用  34
    2.3 盐酸西替利嗪对小鼠皮肤三相过敏反应中SP表达的影响  34
    2.4 统计分析  34
  3 结果  34-37
    3.1 SP在小鼠耳皮肤中的表达  34-35
    3.2 盐酸西替利嗪对小鼠皮肤三相过敏反应的抑制作用  35-36
    3.3 盐酸西替利嗪对小鼠耳皮肤中SP水平的影响  36-37
  4 讨论  37-39
第三部分 P物质受体在人表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞的表达及药物作用研究  39-66
  1 实验材料  39-43
  2 实验方法  43-50
    2.1 细胞培养与传代  43-44
    2.2 免疫组织化学法检测NK-1R在HaCaT细胞和真皮成纤维细胞上的表达  44
    2.3 RT-PCR  44-47
    2.4 流式细胞术检测不同因素及药物对NK-1R在HaCaT细胞和真皮成纤维细胞上的表达调控  47-48
    2.5 Western Blotting检测不同因素及药物对NK-1R在HaCaT细胞和真皮成纤维细胞上的表达调控  48-50
    2.6 统计学分析  50
  3 结果  50-63
    3.1 HaCaT细胞和真皮成纤维细胞的培养  50-51
    3.2 免疫组织化学检测结果  51-52
    3.3 RT-PCR结果  52-58
    3.4 SP、Cet对HaCat细胞和真皮成纤维细胞生存性的影响  58-59
    3.5 流式细胞术检测结果  59-61
    3.6 Western Blotting检测结果  61-63
  4 讨论  63-66
第四部分 P物质对皮肤细胞表达细胞因子、趋化因子的影响及药物作用研究  66-80
  1 实验材料  66-67
  2 实验方法  67-69
    2.1 细胞培养  67
    2.2 SP及盐酸西替利嗪对HaCaT细胞和真皮成纤维细胞表达IFN-γ和IL-10的影响  67-69
    2.3 SP及盐酸西替利嗪对HaCaT细胞和真皮成纤维细胞表达MCP-1的影响  69
    2.4 统计分析  69
  3 结果  69-77
    3.1 IFN-γ和IL-10标准曲线的建立  69
    3.2 SP刺激HaCaT细胞和真皮成纤维细胞表达IFN-γ和IL-10的时效关系  69-71
    3.3 SP刺激HaCaT细胞和真皮成纤维细胞表达IFN-γ和IL-10的量效关系  71-73
    3.4 盐酸西替利嗪对SP诱导HaCaT细胞和真皮成纤维细胞表达FN-γ和IL-10的影响  73-75
    3.5 盐酸西替利嗪对SP诱导HaCaT细胞和真皮成纤维细胞表达MCP-1的影响  75-77
  4 讨论  77-80
第五部分苦参、荆芥对皮肤细胞P物质调控的作用研究  80-98
  1 实验材料  80-82
  2 实验方法  82-84
    2.1 细胞培养  82
    2.2 Mat、Sch对HaCat细胞和真皮成纤维细胞生存性的影响  82
    2.3 流式细胞术检测Mat、Sch对NK-1R在HaCaT细胞和真皮成纤维细胞上表达的影响  82
    2.4 Western Blotting检测Mat、Sch对NK-1R在HaCaT细胞和真皮成纤维细胞上表达的影响  82-83
    2.5 Mat、Sch对SP诱导HaCaT细胞和真皮成纤维细胞表达IFN-γ和IL-10的影响  83
    2.6 Mat、Sch对SP诱导HaCaT细胞和真皮成纤维细胞表达MCP-1的影响  83-84
    2.7 统计分析  84
  3 结果  84-95
    3.1 Mat、Sch对HaCat细胞和真皮成纤维细胞生存性的影响  84-85
    3.2 流式细胞术检测结果  85-87
    3.3 Western Blotting检测结果  87-88
    3.4 Mat和Sch对SP诱导HaCaT细胞和真皮成纤维细胞表达IFN-γ和IL-10的影响  88-92
    3.5 Mat、Sch对SP诱导HaCaT细胞和真皮成纤维细胞表达MCP-1的影响  92-95
  4 讨论  95-98
结论  98-99
参考文献  99-106
致谢  106-107
综述药物经皮作用的新靶点：神经递质与皮肤免疫系统  107-115
附录博士期间发表论文、申请专利、学术会议及获奖情况  115-116

皮肤变态反应中P物质的调控机制及药物作用研究

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