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胚胎发育过程中细胞运动的分子机制：皮层蛋白介导斑马鱼和文昌鱼原肠化运动

作　者: 喻丹
导　师: 张培军；Zhan X Steven
学　校: 中国科学院研究生院（海洋研究所）
专　业: 海洋生物
关键词: 皮层蛋白(cortactin) 斑马鱼文昌鱼原肠化细胞运动
分类号: Q952
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

皮层蛋白(cortactin)是一种微丝细胞骨架调控蛋白,它与肌动蛋白纤丝相结合,参与调控细胞皮层区微丝的聚合和微丝细胞骨架的组织。作为细胞内 Src类酪氨酸蛋白激酶的主要底物,它还代表了一类高度保守的皮层信号蛋白家族。离体实验证明皮层蛋白是细胞运动的重要调控因子,但由于成体组织不透明,难以观察,且细胞运动不活跃,因此一直缺乏相应的体内实验证据。另一方面,细胞运动在所有后生动物发育过程中起重要作用,细胞运动机制的阐明对于形态发生机制的理解具有重要意义,但是由于缺乏动物活体内细胞运动的研究,对个体发育中细胞运动的分子机制至今了解较少。本研究以斑马鱼(Danio rerio)和文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtaoense)胚胎为实验模型,从基因结构、表达图式、功能分析等方面在分子水平、细胞水平、组织水平上系统研究了皮层蛋白调控的活体状态下胚胎发育过程中原肠化细胞运动的分子机制,并探索了脊椎动物进化过程中原肠化形态发生运动的演化。研究首先克隆了斑马鱼皮层蛋白基因,它编码含有 504 个氨基酸残基的蛋白质,蛋白质序列比对表明斑马鱼与高等脊椎动物的皮层蛋白具有高度的序列结构相似性,都含有四个特定的功能域即氨基端的 NTA 结构域,羧基端的 SH3 结构域和位于二者中间的皮层蛋白重复序列结构域和 α-螺旋结构域。研究鉴定了斑马鱼皮层蛋白基因组序列,将其定位到斑马鱼基因组第 19 号染色体上,斑马鱼皮层蛋白基因长度约 7Kb,含 15 个外显子和 14 个内含子。研究还首次鉴定了在斑马鱼第 19 号染色体上存在的一个从硬骨鱼到哺乳动物均高度保守的同线性基因连锁簇 CCND1-ORAOV1-FGF19-FGF4-FGF3- CORTACTIN-SHANK2,利用比较基因组学方法鉴定了斑马鱼基因组中位于该连锁簇中的 2 个新基因 ORAOV1和 SHANK2 及定位于斑马鱼 4 号染色体上的皮层蛋白旁系同源基因 HS1。 Western blotting 检测发现,皮层蛋白在原肠期表达显著提高,整装抗体染色表明在原肠期开始时,皮层蛋白大量表达于胚盾附近区域即未来的胚胎背侧,在发生汇聚迁移的胚盾附近的细胞中分布较多,通过激光扫描共聚焦显微术观察,

全文目录

摘要  2-4
Abstract  4-6
目录  6-9
第一章文献综述  9-43
  一、引言  9-11
  二、为何使用斑马鱼和文昌鱼胚胎作为实验模型？  11-18
    1. 斑马鱼  11-14
      斑马鱼的生物学特性  11-12
      斑马鱼实验系统拥有完备的技术支撑后盾  12-13
      斑马鱼实验系统为探索形态发生运动的机制提供了理想的实验平台  13-14
    2. 文昌鱼  14-16
    3. 斑马鱼和文昌鱼在系统发生上的关系  16-18
  三、斑马鱼的胚胎发育  18-20
  四、斑马鱼胚胎中参予原肠化形态发生运动的细胞谱系  20-21
  五、斑马鱼胚胎发育中的原肠化形态发生运动  21-27
    1. 斑马鱼原肠化细胞运动的类型  21-23
      外包（epiboly）  21
      内卷（involution）  21-22
      汇聚延伸（convergence and extension）  22-23
    2. 斑马鱼原肠化运动的遗传调控  23-25
      外包  23-24
      汇聚和延伸  24
      影响尾部细胞运动的突变体  24-25
    3. 原肠化运动的细胞学研究  25-27
  六、文昌鱼的胚胎发育  27-29
  七、文昌鱼胚胎中参予原肠化形态发生运动的细胞谱系  29-30
  八、文昌鱼胚胎发育中的原肠化细胞运动的类型和形态  30-31
  九、原肠化形态发生运动机制的研究  31-36
    小结  35-36
  十、皮层蛋白：细胞运动的重要调节因子  36-41
    1. 皮层蛋白的结构  36-37
    2. 皮层蛋白的功能  37-41
  十一、皮层蛋白和胚胎发育的关系  41-42
  十二、问题的提出  42-43
第二章斑马鱼皮层蛋白基因及其相关生物信息学研究  43-70
  1 斑马鱼皮层蛋白基因的克隆和系统演化分析  43-52
    一、摘要  43
    二、关键词  43
    三、介绍  43-44
    四、实验材料和方法  44-45
      1. 斑马鱼皮层蛋白基因的克隆  44
      2. 斑马鱼皮层蛋白的氨基酸序列分析  44-45
      3. 鉴定人类，啮齿类，硬骨鱼类，两栖类，腔肠动物，昆虫中斑马鱼皮层蛋白基因的直系同源基因（orthologs）  45
      4. 皮层蛋白的系统演化分析  45
    五、结果  45-51
      1. 斑马鱼皮层蛋白基因的序列  45-46
      2. 斑马鱼皮层蛋白的氨基酸序列，功能域和三维结构预测  46-48
      3. 皮层蛋白的系统演化分析  48-51
    六、讨论  51-52
  2 斑马鱼皮层蛋白基因的基因组序列、所在连锁基因群的定位和比较基因组学分析、进化保守性的发现及相关新基因的鉴定  52-70
    一、摘要  52
    二、关键词  52
    三、介绍  52-53
    四、实验材料和方法  53-54
      1. 斑马鱼基因组中皮层蛋白基因的定位  53
      2. 斑马鱼皮层蛋白基因的结构分析  53-54
      3. 比较基因组分析  54
    五、实验结果和讨论  54-70
      1. 斑马鱼皮层蛋白基因（Cortactin）的基因组序列结构  54-58
      2. 斑马鱼ORAOV1基因的鉴定  58-60
      3. 斑马鱼HS1基因的鉴定  60-62
      4. 斑马鱼 SHANK2 基因的鉴定  62-65
      5. 斑马鱼CCND1，ORAOV1，FGF19，FGF4，FGF3 基因在斑马鱼基因组中的定位  65
      6. CCND1,ORAOV1,FGF19,FGF4,FGF3，Cortactin，SHANK2 在斑马鱼（Dani1erio）、人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)、大鼠(Rattus norvegicus)、鸡(Gallugallus)，爪蟾（Xenopus）、Tetraodon nigroviridis，Fugu rubripes 基因组中的定位和脊椎动物中CCND1－SHANK2 连锁同  65-70
第三章皮层蛋白在斑马鱼原肠期胚胎发育过程中的表达图式  70-84
  一、摘要  70
  二、关键词:  70-71
  三、介绍  71
  四、实验材料和方法  71-76
    1. 斑马鱼的养殖和胚胎的获得  71-72
    2. 实验仪器和试剂  72-74
    3. Western Blotting 分析  74-75
    4. 斑马鱼胚胎整装抗体染色  75
    5. 激光共聚焦显微术  75-76
  五、实验结果  76-81
    1. 皮层蛋白在斑马鱼胚胎发育过程表达水平的变化  76-77
    2. 皮层蛋白在斑马鱼原肠化过程中的时空表达图式  77
    3. 皮层蛋白在发育中的神经系统的表达  77-79
    4. 斑马鱼原肠化过程中皮层蛋白特异定位在胚胎细胞皮层区域并且在胚盾区呈现极性分布  79-81
  六、讨论  81-84
第四章皮层蛋白在斑马鱼胚胎中的过量表达分析  84-96
  一、摘要  84
  二、关键词  84
  三、介绍  84-85
  四、实验材料和方法  85-92
    1. 斑马鱼的养殖和胚胎的获得  87
    2. 表达质粒的制备  87
    4. 质粒线性化  87-88
    5. 显微注射  88
    6. 斑马鱼胚胎整装抗体染色  88
    7. 斑马鱼胚胎整装原位杂交  88-91
    8. 激光共聚焦显微术  91-92
    9. 图片处理  92
  五、实验结果和讨论  92-96
第五章文昌鱼原肠化细胞运动的分子机制研究  96-115
  一、摘要  96
  二、关键词  96
  三、介绍  96-99
  四、实验材料和方法  99-102
    1. 文昌鱼胚胎的采集  99
    2. Western Blotting 分析  99
    3. 文昌鱼胚胎整装抗体染色  99-100
    4. 文昌鱼胚胎整装荧光原位杂交  100-101
    5. 药物处理  101
    6. 扫描电子显微术（SEM）  101-102
  五、实验结果  102-112
    1. Western Blotting 分析  102
    2. 皮层蛋白、Arp2/3 复合物和FGFR 在文昌鱼胚胎发育过程中的表达图式  102-107
    3. 文昌鱼原肠化运动的SEM 研究  107-109
    4. SU5402 处理后文昌鱼胚胎的发育  109-112
  六、讨论  112-115
总结  115-118
参考文献  118-131
发表文章  131-132
致谢  132-133
国画－斑马鱼  133

胚胎发育过程中细胞运动的分子机制：皮层蛋白介导斑马鱼和文昌鱼原肠化运动

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