学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

短小芽孢杆菌表达系统的优化研究

作　者: 陈云鹏
导　师: 沈大棱
学　校: 复旦大学
专　业: 遗传学
关键词: 短小芽孢杆菌表达系统优化研究突变体启动子抗性水平绿色荧光蛋白氯霉素肠杆菌动活性
分类号: Q785
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
下　载: 305次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

真菌病害是造成农作物产量损失的重要原因之一,利用天然的或经遗传改良的微生物进行植物真菌病害的防治是当前国际上较为活跃的研究领域之一。本实验室已从水稻叶片上分离出一株附生菌 DX01,经试验证明该菌具有天然拮抗某些真菌的特性,若能进一步将其定向改造成具有更强抗真菌能力的工程菌,作为生物农药的有效组分,从而可以减少因使用化学农药而造成的环境污染,无疑具有重要的理论和现实意义。绿色荧光蛋白(GFP)基因作为标记基因,被广泛应用于环境微生物学方面,由于其表达稳定,容易观测,因此,也可以作为启动子活性的报告基因。为了进一步优化短小芽孢杆菌表达系统,以 GFP 作为报告基因,对克隆自 DX01 菌株的启动子进行了一系列的研究。采用 PCR 技术,亚克隆来自短小芽孢杆菌 (Bacillus brevis) DX01 菌株总基因组中的启动子活性片段 F1,分别构建了大肠杆菌组成型表达载体pUC118-F1gfp 和一个大肠杆菌-短小芽孢杆菌穿梭表达载体 pHY300-F1gfp,以缺失启动子的绿色荧光蛋白 (GFP) 基因为报告基因,检测了该片段在大肠杆菌DH5α 和短小芽孢杆菌 DX01 菌株中的启动活性,在荧光显微镜下,均观察到了明亮的绿色荧光,证实活性片段 F1 具有组成型启动子的功能,gfp 基因在 2 种宿主细胞中实现了组成型表达。该表达结果为 Western 印迹所证实。对 2 种宿主表达细胞中 GFP 蛋白的表达量作了 FACS 分析,结果表明 gfp 基因在 DX01 细胞中的表达强度约为 DH5α 中的 2 倍。运用来自噬菌体 Mu 的转座酶 MuA,对启动子 F1 进行了随机插入突变,从中筛选出 13 个 F1 的突变体。对突变体的氯霉素抗性检测表明,与 F1 对照相比,7 个含相应突变体的菌株其氯霉素抗性水平有显著提高,其中突变体 Fm3 和Fm10 抗性提高了 3.6 倍,可抗高达 900μg/mL 氯霉素,揭示这些启动子突变体有着更高的启动活性;4 个突变体氯霉素抗性水平下降;2 个突变体抗性水平基本不变。CAT-ELISA 检测的结果,也进一步证实了氯霉素抗性水平的变化与 CAT酶活力的变化有着密切的关系。在启动子 F1 的 DNA 序列上,存在着不同插入效应敏感位点,在这些位点附近的插入突变,可使启动活性急剧变化,并且相邻的插入位点,其突变效应可能完全不同。FACS 分析表明,在大肠杆菌中表现为启动活性增强的 F1 突变体,转入短小芽孢杆菌 DX01 后其活性仍表现为增强。采用 RT-PCR 方法,克隆了萝卜抗真菌蛋白 1(Rs-AFP1)的 cDNA 全长,在该 VI<WP=9>基因的上游连上了一个短小芽孢杆菌 47 株的中壁蛋白(MWP)信号肽,将 Rs-afp1基因的终止密码子突变掉,其后接上绿色荧光蛋白(GFP)基因和 T7 终止子,分别构建成AFP-GFP融合蛋白表达载体pUC118-F1SP’ 和pHY300-F1SP’ 。 Agfp AgfpWestern 杂交证实融合蛋白在大肠杆菌 DH5α 中得到了表达。 [附录部分] 杂交墨西哥落羽杉是我国已故著名林木育种家叶培忠教授于 1963 年通过墨西哥落羽杉(母本)与柳杉(父本)杂交所获得的新种。目前,其主要分布在上海、江苏等地。杂交墨杉苗期长势不突出,早年并未引起林木工作者的注意,故目前这些杂交墨西哥落羽杉的分布情况已很难从原始档案中查找到完整的资料。为此,采用随机引物扩增多态性 DNA(RAPD)技术,对 8 个可能是杂交墨西哥落羽杉片林样本、其杂交母本?墨西哥落羽杉和杂交父本的同类?柳杉,共计 12 个样本进行了亲缘关系鉴定和遗传多样性分析。从 31 个随机引物中筛选出 17 个引物,共扩增出 164 条带。其中,多态带有 162 条,占全部条带的 98.8 %。检测结果表明:在 8 号、11 号、12 号 3 个柳杉样本中,11 号样本与原杂交父本的亲缘关系最近;1 号、4 号和 9 号三个片林样本是杂交墨杉群落的可能性最大;5 号片林样本可能是未杂交的墨杉纯林;其他群落的样本是否为杂交墨杉尚不能通过该实验得出明确结论。

全文目录

中文摘要  8-10
英文摘要  10-12
文献综述  12-26
  1 植物抗真菌蛋白的分离及基因克隆的研究进展  12-20
    1.1 几丁质酶  12-14
    1.2 β-1,3 葡聚糖酶  14-16
    1.3 核糖体失活蛋白  16-17
    1.4 其它抗真菌蛋白  17-20
      1.4.1 天麻抗真菌蛋白  17
      1.4.2 杜仲抗真菌蛋白  17-18
      1.4.3 萝卜抗真菌蛋白  18-19
      1.4.4 水稻抗真菌蛋白  19
      1.4.5 橡胶蛋白  19-20
  2 绿色荧光蛋白(GFP)基因作为标记基因研究进展  20-22
  3 短小芽孢杆菌是真核基因表达的良好宿主菌  22-24
  4 转座插入突变在基因功能分析上的应用现状  24-26
第一章绿色荧光蛋白(GFP)基因在短小芽孢杆菌中的组成型表达研究  26-45
  1 材料  27-29
    1.1 菌株和质粒  27
    1.2 主要试剂  27
    1.3 主要的仪器和设备  27-29
  2 方法  29-38
    2.1 细菌培养条件  29
    2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备  29
    2.3 大肠杆菌的转化  29
    2.4 大肠杆菌小量质粒的提取  29-30
    2.5 质粒的酶切反应  30
    2.6 酶切产物的回收与连接  30-31
    2.7 线性化载体去磷酸化反应  31
    2.8 短小芽孢杆菌的电击转化  31-32
    2.9 短小芽孢杆菌 DX01 菌株基因组 DNA 的提取  32
    2.10 短小芽孢杆菌 DX01 菌株质粒的提取  32-33
    2.11 短小芽孢杆菌组成型启动子活性片段 F1 的亚克隆  33
    2.12 短小芽孢杆菌 gfp 基因组成型表达载体的构建  33-34
    2.13 荧光检测  34
    2.14 短小芽孢杆菌 GFP 阳性菌总蛋白的 SDS-PAGE 电泳  34
    2.15 短小芽孢杆菌 GFP 表达的免疫印迹检测  34-36
    2.16 GFP 蛋白表达的荧光激活细胞分检分析  36-37
    2.17 表达 gfp 基因的短小芽孢杆菌工程菌在水稻上的示踪分析  37-38
  3 结果与讨论  38-45
    3.1 短小芽孢杆菌 DX01 启动子 pCP01 功能片段 F1 的亚克隆  38-39
    3.2 pUC118-F1gfp 和 pHY300-F1gfp 原核表达载体的构建  39-40
    3.3 含表达载体 pUC118-F1gfp 的大肠杆菌荧光检测  40
    3.4 含表达载体 pHY300-F1gfp 的短小芽孢杆菌荧光检测  40-41
    3.5 短小芽孢杆菌 GFP 组成型表达的 Western-blotting 鉴定  41-42
    3.6 gfp 基因表达的流式细胞仪荧光激活细胞分检分析  42-43
    3.7 gfp 标记的短小芽孢杆菌在土壤中的示踪  43-44
    3.8 gfp 标记的短小芽孢杆菌在水稻叶片上的示踪  44-45
第二章 MuA 转座酶介导的启动子 F1 随机插入突变的研究  45-60
  1 材料与方法  45-54
    1.1 材料  45-48
      1.1.1 菌株和载体  45-46
      1.1.2 试剂和酶制剂  46-48
    1.2 方法  48-54
      1.2.1 PCR 亚克隆组成型启动子 F  148-48
      1.2.2 启动子活性片段 F1 随机插入突变  48-50
      1.2.3 F1 随机插入突变 Cm 抗性水平的测定  50-51
      1.2.4 含 ECE7-FmX 突变体的大肠杆菌 CAT-ELISA 测定  51-52
      1.2.5 短小芽孢杆菌 DX01 表达载体 pHY300-FmX' gAFP 的构建  52-54
  2 结果与分析  54-60
    2.1 启动子活性片段 F1 随机插入突变  54-55
    2.2 F1 随机插入突变体 Cm 抗性水平及 CAT 合成量的测定  55-56
    2.3 系列载体的酶切验证  56-57
    2.4 增强的突变启动子调控下的 gfp 基因在 DX01 中的表达  57-60
第三章萝卜抗真菌蛋白 1(Rs-AFP1)基因在大肠杆菌中的融合表达研究  60-79
  1 材料  61
    1.1 萝卜品种  61
    1.2 真菌菌种  61
    1.3 细菌与载体  61
    1.4 主要试剂  61
  2 方法  61-72
    2.1 萝卜种子培养条件  61
    2.2 真菌培养条件  61-62
    2.3 萝卜幼苗总 DNA 抽提方法  62
    2.4 萝卜幼苗总 RNA 的提取  62-63
      2.4.1 RNA 提取过程中的注意事项  62-63
      2.4.2 提取方法  63
    2.5 萝卜抗真菌蛋白 1(Rs-AFP1)基因的 PCR 克隆  63
    2.6 Rs-afp1 cDNA 第一链的合成  63-64
    2.7 RT-PCR 扩增 Rs-afp1 cDNA  64
    2.8 表达载体 pUC118-F1SPAFP 的构建  64-65
    2.9 含信号肽和 T7 终止子的 AFP 系列表达载体构建  65-67
    2.10 表达载体 pUC118-F1SP'AFP 的构建  67-68
    2.11 表达载体 pUC118-F1SP'Agfp 的构建  68-69
    2.12 表达载体 pHY300-F1SP'Agfp 的构建  69-71
    2.13 工程菌活性鉴定  71-72
  3 结果与讨论  72-77
    3.1 Rs-afp1 基因的 PCR 克隆和其 cDNA 片段的 RT-PCR  72-74
    3.2 DX01 菌对病原真菌的拮抗作用  74
    3.3 工程菌拮抗真菌活性测定  74-75
    3.4 融合蛋白在大肠杆菌中表达的分子检测  75-77
  附录部分文献综述--RAPD 分子标记在植物遗传育种中的应用  77-79
    1 RAPD  77-78
    2 DAF  78
    3 AP-PCR  78-79
第四章利用 RAPD 技术推测杂交落羽杉群落间的亲缘关系  79-93
  1 材料  80
  2 方法  80-82
    2.1 落羽杉和柳杉的基因组总 DNA 的提取  80-81
    2.2 随机引物  81
    2.3 RAPD-PCR 反应  81
    2.4 统计分析  81-82
  3 结果与分析  82-91
    3.1 不同引物对供试样本的扩增效率  82
    3.2 杂交墨西哥落羽杉的母本及柳杉的带型特征  82-84
    3.3 样本间的遗传距离及亲缘关系分析  84-87
    3.4 八个片林样本的 RAPD 鉴定结果分析  87-91
  4 讨论  91-93
    4.1 关于柳杉基因组总 DNA 的提取  91
    4.2 关于 RAPD 反应体系的优化  91
    4.3 RAPD 技术用于杉科植物亲缘关系鉴定的可行性  91-93
参考文献  93-106
致谢  106-107

短小芽孢杆菌表达系统的优化研究

内容摘要

全文目录

相似论文