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小麦（Triticum aestivum L.）种质资源的耐盐性鉴定及其相关基因的挖掘

作　者: 马雅琴
导　师: 董玉琛；翁跃进
学　校: 中国农业科学院
专　业: 作物遗传育种
关键词: 小麦耐盐性耐盐基因 mRNA差异显示 cDNA-AFLP 醛脱氢酶基因
分类号: S512.1
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

土壤盐渍化是影响农业生产和生态环境的主要非生物逆境之一。随着人口的增加和耕地的减少，如何开发利用盐渍化土壤己成为农业生产和环境生态亟待解决的问题。利用生物技术深入开展种质资源的耐盐性研究，挖掘其中优异耐盐相关基因，培育耐盐作物新品种，是改良和利用盐渍化土地，增加粮食产量和维持农业可持续发展最为经济有效的策略。本研究以从美国引进的28份耐盐小麦种质为实验材料，旨在通过系统的实验室芽期、苗期和全生育期的耐盐性鉴定，筛选出耐盐种质：进一步对小麦耐盐种质进行耐盐生理指标的测定；利用差异显示技术克隆小麦耐盐相关基因。本研究取得如下研究成果： 1、小麦芽期、苗期和全生育期耐盐鉴定从28份引进的小麦种质中筛选出13份芽期相对盐害率在20％以下，苗期盐害指数在40％以下的耐盐材料，进一步在0.37％以上的盐渍化土壤上进行全生育期的耐盐性鉴定，通过对株高、穗长、穗数、穗粒数、千粒重等生产要素的考种分析，发现13个材料可被分成3个不同等级的耐盐资源。对两个突出的耐盐材料SW10和SW12进行大区生产示范试验，田间测产方差分析表明，在全盐量为0.35％-0.54％的盐渍化土壤上，SW10和SW12的每公顷比对照宁春4号增产1500 Kg，产量差异达到极显著水平。经品种审定后这两个品种可直接用于宁夏盐渍地地区的生产。 2、小麦SW12耐盐种质生理指标测定 HPLC-ESI-MS分析表明，SW12和两个对照品种宁春4号和中国春在6个不同盐浓度(0、100、200、300、400和500 mmol／L NaCl)和6个不同的盐胁迫时段中(1、3、5、10、20和30d)，随着盐胁迫强度的增加，它们叶片组织中甜菜碱、脯氨酸和丙二醛的含量均有不同程度的增加，3个品种在5种不同盐浓度下，甜菜碱和丙二醛的含量存在很大差异。方差分析结果显示，在盐胁迫条件下3个品种间，其叶片甜菜碱含量差异达到极显著水平；丙二醛的增长量差异达到显著水平：SW12的甜菜碱含量高于宁春4号，更高于中国春；SW12的丙二醛变化量低于宁春4号，更低于中国春。表明SW12的耐盐性＞宁春4号＞中国春。该结论与田间耐盐性鉴定结果一致，进一步说明SW12是高效的耐盐基因的载体。中国农业科学院博士学位论文摘要3、小麦SW12耐盐相关基因Ta一LDH的克隆利用eDNA一AFLP和RACE等技术，从430 mmol/L盐胁迫下的小麦SW12中首次分离出了一个醛脱氢酶(Aldehyde nehydrogenase)类似基因的全长eDNA，命名为儿胡LDHoTa一乙DH含有1 948个核营酸，编码一条由509个氨基酸组成的多肤，在其3’端，距离终止子约235 bp处有一个明显的加尾信号序列(AATAAA)。在NCBI CDD数据库对其蛋白质分析结果表明，几叨乙DH的蛋白质序列与一个己知的醛脱氢酶基因家族(pfam0O171)的氨基酸序列有98%的同源性，在其第266到273位氨基酸之间有一个典型的醛脱氢酶谷氨酸活性位点(Azdehyde dehydrogenases glutamie aesdactive site)。据此推断Ta明乙DH为一个醛脱氢酶基因家族成员。系统发生学分析表明几一LDH与antiquitin类似功能的醛脱氢酶基因同属于一个发生种群，其主要功能是催化由于盐胁迫导致的细胞膜脂过氧化所产生的高毒性丙二醛发生氧化，形成无毒的梭酸，从而抑制细胞膜脂的过氧化反应，降低由活性氧物质造成的氧化胁迫，维持细胞的生存，最终缓解盐胁迫，表现耐盐性。RT一PCR结果显示，儿一LD厅是一个盐诱导上调表达的基因。

全文目录

学位论文评阅人和答辩委员会  3-4
独创性声明和版权授权书  4-5
中文摘要  5-7
Abstract  7-9
目录  9-12
第一章绪论  12-34
  1.1 文献综述  12-30
    1.1.1 国内外植物耐盐机制的研究进展  12-16
      1.1.1.1 盐胁迫对植物的危害  12-13
      1.1.1.2 植物耐盐机理  13-16
    1.1.2 国内外植物耐盐相关基因的研究进展  16-27
      1.1.2.1 植物在盐胁迫下诱导表达的基因及其产物  16-22
      1.1.2.2 植物对盐胁迫应答的信号传导途径  22-24
      1.1.2.3 胁迫诱导基因的调控与表达  24-25
      1.1.2.4 植物耐盐基因工程研究  25-27
    1.1.3 生物信息学在植物耐盐研究中的应用  27-30
  1.2 研究目的和实验设计  30-34
    1.2.1 研究的目的和意义  30
    1.2.2 立题依据  30-31
    1.2.3 实验原理和实验设计  31-32
    1.2.4 技术路线  32-34
第二章小麦种质耐盐性鉴定评价  34-47
  2.1 引言  34
  2.2 材料和方法  34-47
    2.2.1 材料  34-35
    2.2.2 方法  35-37
      2.2.2.1 芽期耐盐性鉴定方法  35
      2.2.2.2 苗期耐盐性鉴定方法  35-36
      2.2.2.3 全生育期耐盐性鉴定  36
      2.2.2.4 耐盐品系大区生产示范  36-37
      2.2.2.5 统计分析  37
    2.2.3 结果与分析  37-46
      2.2.3.1 芽期耐盐鉴定结果  37-38
      2.2.3.2 苗期耐盐鉴定结果  38
      2.2.3.3 田间盐胁迫下的性状表现  38-46
    2.2.4 讨论  46-47
第三章小麦耐盐相关生理指标测定及其耐盐性分析  47-63
  3.1 引言  47-48
  3.2 材料和方法  48-50
    3.2.1 材料  48
    3.2.2 方法  48-50
  3.3 结果与分析  50-61
    3.3.1 甘氨酸甜菜碱的测定结果  50-54
      3.3.1.1 盐胁迫对小麦叶片中甜菜碱含量的影响  50-52
      3.3.1.2 不同小麦品种中甜菜碱含量的变化和其耐盐性  52-54
    3.3.2 脯氨酸的测定结果  54-57
      3.3.2.1 盐胁迫对小麦叶片中脯氨酸含量的影响  54-56
      3.3.2.2 不同小麦品种中脯氨酸含量的变化和其耐盐性  56-57
    3.3.3 丙二醛的测定结果  57-61
      3.3.3.1 盐胁迫对小麦叶片中丙二醛含量的影响  58-60
      3.3.3.2 不同小麦品种中丙二醛增长量的变化及其耐盐性  60-61
  3.4 讨论  61-63
第四章小麦醛脱氢酶(Aldehyde Dehydrogenase)基因的分离与克隆  63-94
  4.1 引言  63-64
  4.2 材料和方法  64-77
    4.2.1 材料  64-65
    4.2.2 方法  65-77
      4.2.2.1 材料培养及盐处理  65
      4.2.2.2 RNA提取及cDNA合成  65-67
      4.2.2.3 cDNA-AFLP技术  67-70
      4.2.2.4 产物回收  70
      4.2.2.5 克隆技术  70-73
      4.2.2.6 反向Northren点杂交  73-74
      4.2.2.7 RACE获得全长cDNA  74-77
      4.2.2.8 生物信息学分析  77
  4.3 结果与分析  77-92
    4.3.1 高质量RNA的获得  77-78
    4.3.2 cDNA合成  78
    4.3.3 差异表达片段的筛选  78-79
    4.3.4 差异片断的回收和克隆  79
    4.3.5 阳性EST筛选及其克隆  79-80
    4.3.6 全长cDNA的获得  80-81
    4.3.7 Ta-ALDH生物信息学分析及其功能预测  81-90
      4.3.7.1 Ta-ALDH核酸相似性分析  81-83
      4.3.7.2 Ta-ALDH的开放阅读框架分析及其核酸和氨基酸结构  83-85
      4.3.7.3 Ta-ALDH的氨基酸序列多重对齐分析  85-87
      4.3.7.4 Ta-ALDH的蛋白质序列分析及其功能位点预测  87-88
      4.3.7.5 醛脱氢酶基因的系统发生学分析  88-89
      4.3.7.6 Ta-ALDH的结构特性描述  89-90
    4.3.8 Ta-ALDH的表达和SW 12耐盐机理相关性的逻辑推断  90-92
      4.3.8.1 盐胁迫对SW12叶片中丙二醛影响  90
      4.3.8.2 盐胁迫对三个小麦品种的MDA含量的影响  90-92
      4.3.8.3 Ta-ALDH为盐诱导上调表达基因  92
  4.4 讨论  92-94
第五章结论  94-95
参考文献  95-112
附录  112-121
  1 本研究所涉及的引物序列  112-115
  2 部分试剂配制  115-118
  3 缩略表  118-119
  4 10个EST序列  119-121
致谢  121-122
作者简介  122

小麦（Triticum aestivum L.）种质资源的耐盐性鉴定及其相关基因的挖掘

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