学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

TIE2受体介导的靶向性非病毒载体的构建

作　者: 韩峻松
导　师: 顾健人
学　校: 复旦大学
专　业: 病原生物学
关键词: Tie2 促血管生成素靶向性非病毒载体基因治疗 p53
分类号: R346
类　型: 博士论文
年　份: 2002年
下　载: 88次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

恶性肿瘤是正常染色体受多重损伤的一种疾病，它的发生和发展是外界环境和遗传因素共同作用所致。对于这样一种复杂的疾病，单纯依靠少数几种手段进行治疗是不够的，所以在手术、放疗、化疗等方法之外，用基因疗法治疗肿瘤是现在研究比较集中的领域。到目前为止，全世界范围内已有六百多种基因治疗方案获准进入临床试验，其中恶性肿瘤治疗方案占63.1%[1]。但遗憾的是，尚未有一种方案真正成为临床治疗有明显效果并成为常规治疗的方案。所以针对基因治疗中所使用的载体和治疗基因的研究具有重要的意义和紧迫性。目前，肿瘤基因治疗的靶细胞主要是肿瘤细胞，通过导入细胞因子，抑癌基因，癌基因的反义基因或"自杀基因"等进行治疗。但是由于肿瘤的异质性，一种生物疗法往往只能针对某一种肿瘤。为解决这个问题，Folkman博士提出了抗血管生成疗法，希望通过"饿死"肿瘤的办法来进行治疗。他认为，各种肿瘤有一个共性，就是当实体肿瘤生长到体积大于1-2mm3后，必须有新生血管形成，为其生长提供足够的养料，并为肿瘤细胞进入血液循环和转移到远处提供可能，抑制肿瘤新生血管生成可能会抑制多种肿瘤的生长[2,3,4]。虽然目前认为，并不是所有的肿瘤的生长都依赖于血管新生，但这种办法仍有相当重要的价值。Angiopoietin-1(Ang1)是Tie-2受体的配体，在体外不能直接促进培养的内皮细胞生长，据推测它可能在血管生成过程的后期起作用，使血管的官腔形成及网络稳定。Angiopoietin-2(Ang2)，也可与Tie2受体结合，它的功能可能是与Ang1拮抗，使血管网处于一种不稳定的状态，有利于内皮细胞的分裂和血管网的重新建立。这两种配体的受体-Tie2，属于蛋白质酪氨酸激酶家族。它的表达具有相对特异性，在正常人体内主要表达于血管内皮细胞和一些造血细胞表面。在多种肿瘤，如乳腺癌、肺癌、膀胱癌等，及这些肿瘤内的血管中， <WP=5>Ang1和Tie2受体的表达均增高。基于以上这些因素，我们决定尝试构建一种新的非病毒基因转移系统GA，该系统可将外源基因导入Tie2受体高表达的新生血管内皮细胞和肿瘤细胞。研究主要包括以下三个部分：1. 通过GA1基因转移系统转导报告基因(-gal，观察该系统是否可以在体内外将外源基因导入靶细胞，同时观察报告基因在体内主要脏器的分布和不同时间的分布情况。2. GA1基因转移系统体内转导pCEP-p53基因，观察导入基因能否抑制肿瘤的生长。3. 配体寡肽GA1与Tie2受体的结合试验。第一部分 TIE2受体介导的GA1基因转移系统转导(-gal的体内外导入实验由于促血管生成素与受体的结合区域尚属未知。所以首先，根据文献的报道，确定了一个促血管生成素中可能与受体结合的一个大致的范围，然后通过同源序列比较和疏水性分析，确定了一段可能的序列。当然这段序列是否可行需要通过实验的检验。用双功能交联剂将配体寡肽GA1、HA20分别与多聚赖氨酸共价结合，然后包裹报告基因CMV-(-gal，进行体外实验。由于我们没有合适的血管内皮细胞株，通过免疫组化筛选，发现SPC-A1肺腺癌细胞有较高的Tie2受体表达。体外培养的细胞共分为三组，一组使用生理盐水，一组使用裸DNA（pCMV-(-gal），另一组使用GA1-PL/HA20-PL/pCMV-(-gal。结果表明，GA1载体系统可以将外源基因导入Tie2受体高表达的细胞。然后，我们进行体内实验。使用GA1-PL/HA20-PL/pCMV-(-gal，分别对九种肿瘤SPC-A1、SMMC-7721、A375、SGC-7901、SK-OV-3、宫颈癌移植瘤和两种肝癌移植瘤通过瘤周注射进行体内导入实验，结果表明，在多种肿瘤组织的切片中观察到在部分血管内皮细胞中有报告基因的表达；另外经免疫组化检测，在多种肿瘤组织细胞的表面有Tie2受体的表达，在这些细胞内也观察到报告基因的表达。<WP=6>同时我们对报告基因在不同时间的表达情况和在裸鼠体内不同脏器内的分布情况进行了研究。结果表明，在瘤周注射了GA1基因转移系统后，(-gal在24小时后就有表达，在48小时达到高峰，72小时起开始下降，而到168小时，仍有表达。报告基因在脾脏中有一定数量的表达，而在心、肺、肝、肾中未见明显的表达，胃、肠粘膜虽也可见蓝染，但未进行任何处理的裸鼠对胃、肠染色也可见蓝染，指示上述组织可能存在内源性的半乳糖苷酶活性。第二部分 GA1基因转移系统介导p53的体内有效实验使用A375人黑色素瘤裸鼠模型，待肿瘤长到直径约为0.3-0.4cm时，挑选出瘤体均匀的动物，随机分为5组，每组6只备用。分组如下：①生理盐水组，②非病毒载体组(1μg GA1-PL)，③单纯质粒pCEP-p53组(1μg pCEP-p53质粒)，④低剂量组（每只注射相当于0.2μg质粒的四元复合体基因转移系统），⑤高剂量组（每只注射相当于1μg质粒的四元复合体基因转移系统）。每周注射一次，持续1个月。每周用游标卡尺测量裸鼠皮下瘤体的长(a)、短(b)径，根据V=(ab2/6计算瘤体积。结果表明，五个组的平均值分别为：① 1.498 ± 0.600cm3 ② 1.734 ± 0.811cm3 ③ 1.727 ± 0.526 cm3 ④ 1.169 ± 0.381cm3 ⑤ 0.731 ± 0.328cm3，高剂量组与①、②、③组相比，抑制率分别为51.2%、57.8%、57.7%，并且与三?

全文目录

中文摘要  4-8
英文摘要  8-12
前言  12-15
第一部分 TIE2受体介导的GA1基因转移系统转导-βgal的体内外导入实验  15-31
  材料与方法  15-21
  结果  21-31
第二部分 GA1基因导入系统介导p53的体内有效实验  31-34
  材料与方法  31-33
  结果  33-34
第三部分 GA1与受体的结合实验  34-40
  材料与方法  34-38
  结果  38-40
讨论  40-48
参考文献  48-54
综述  54-63
参考文献  63-69
附录  69-81
致谢  81-82

TIE2受体介导的靶向性非病毒载体的构建

内容摘要

全文目录

相似论文