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用于单碱基错配识别的核酸微阵列新技术
作 者: 王宏
导 师: 陆祖宏
学 校: 东南大学
专 业: 生物医学工程
关键词: 核酸微阵列 分子信标探针 单碱基 微阵列杂交 琼脂糖 新技术 聚丙烯酰胺 目标序列 解链曲线 错配
分类号: R346
类 型: 博士论文
年 份: 2003年
下 载: 159次
引 用: 1次
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内容摘要
随着人类基因组计划的完成和后基因组时代的到来,人们越来越认识到单核苷酸多态性(又称SNP)和突变在个体的表型差异、不同群体和个体对疾病,特别是对复杂疾病的易感性以及对各种药物的耐受性和对环境因子的反应研究中的重要意义。基因芯片技术为大规模单核苷酸多态性和突变检测提供了一种高通量、高灵敏度、快速和可靠的研究手段。用于单核苷酸多态性和突变检测基因芯片存在两个关键性的技术问题:第一是样品标记。样品标记过程不仅费用昂贵、耗时耗力,而且可能改变样品中目标序列的初始比例,影响了实验结果的可靠性。第二是单碱基错配识别的可靠性。固定化的核酸探针对单碱基错配的区分能力远低于均相体系中的核酸探针;同时,在生物芯片上集成了大量不同的核酸探针,很难使所有探针在同一条件下具有最佳的单碱基错配识别能力。为解决以上问题,本论文工作围绕分子信标微阵列芯片和基于生物芯片的解链曲线分析方法进行了研究。论文的主要研究结果包括以下8个方面:1. 设计了一种氨基修饰的分子信标寡核苷酸探针。这种分子信标由三部分组成:(1)16个碱基的环状区和6个碱基的茎秆区形成发夹式结构;(2)5’端中间和3’端的末端分别修饰了荧光素和二甲氨基偶氮苯甲酰基 (DABCYL)作为荧光基团及猝灭基团;(3)5’端修饰的氨基的通过20个碱基的胸腺嘧啶与发夹结构相连。 氨基修饰的分子信标仍能维持稳定的发夹式结构和良好的杂交特异性,可用于制备分子信标微阵列,实现对非标记目标序列的检测。研究了分子信标探针在氨基硅烷玻片、聚丙烯酰胺膜和琼脂糖膜等三种不同基片上的固定方法。氨基硅烷玻片表面的氨基可与戊二醛反应衍生出醛基;戊二醛的聚合体的双键可与聚丙烯酰胺中的酰胺基反应后衍生出醛基;高碘酸钠可温和的氧化琼脂糖中相邻的羟基产生醛基。不同基片活化后衍生的醛基可与氨基修饰的分子信标寡核苷酸探针反应形成Schiff碱,经硼氢化钠等还原剂还原后形成稳定的烷胺键化合物。在实验中使用的最高浓度(100μM)<WP=6>2. 范围内,聚丙烯酰胺膜和琼脂糖膜上固定的分子信标探针的荧光强度随点样浓度成线性变化关系,表明聚丙烯酰胺膜和琼脂糖膜具有较大的固定能力。 3. 研究了三种基片固定的分子信标微阵列在不同条件下的复性效率。结果表明,复性效率随着离子强度的增加而增加。在100mM、50mM和10mM MgCl2的Tris-HCl(pH=8)缓冲液中氨基硅烷玻片、聚丙烯酰胺膜和琼脂糖膜固定的分子信标微阵列的复性效率分别达到饱和,荧光强度分别为初始值的60%,30%和20%。聚丙烯酰胺膜和琼脂糖膜具有较大的固定能力,并提供了一种近似于液体的反应环境,大大增加了参加杂交反应的分子信标探针的数量,提高了杂交信号强度。4. 研究了三种基片固定的分子信标微阵列在不同条件下及与不同目标序列杂交的结果。在较低的离子强度下(10mM MgCl2),从聚丙烯酰胺膜和琼脂糖膜固定的分子信标微阵列杂交图象中,即可清楚的识别目标序列。 计算了不同离子强度条件下的单碱基错配识别比例,在较低的离子强度下(10mM MgCl2), 琼脂糖膜固定的分子信标微阵列的单碱基错配识别比例(0.81),高于固定化的直链寡核苷酸分子探针(0.3-0.7),证明了这一固定方法保持了分子信标探针的高特异性。5. 研究了三种基片固定的分子信标微阵列在不同条件下的杂交反应动力学。 结果表明,三种基片固定的分子信标微阵列的杂交反应均能在数分钟内完成。对琼脂糖膜固定的分子信标微阵列,研究了初始反应速度与目标序列浓度之间的关系,结果表明在1nM 至20nM 范围内,初始反应速度与目标序列浓度表现出较好的线性关系。这一方法可用于确定样品中目标序列浓度。研究了琼脂糖膜固定的分子信标微阵列与实际PCR产物的杂交结果。 分别使用大肠杆菌O157:H7的毒力因子fliC H7及rfbE 及人类apoE基因PCR的产物与琼脂糖膜固定的分子信标微阵列杂交,取得了与对照实验相一致的结果。实验结果表明,琼脂糖膜固定的分子信标微阵列可应用于实际样品的非标记检测。由于样品未进行标记,而且单碱基识别的特异性是由分子信标茎环结构的热力学平衡关系所保证的,所以杂交反应完成后,无须进行清洗以保证严格度。因此,琼脂糖膜固定的分子信标微阵列不会因多孔材料清洗困难而产生的高背景信号;当其应用于芯片实验室(Lab-on-a-chip)等微型器件中时,由于无须考虑微小体积内清洗的问题,大大简化了器件设计。因而琼脂<WP=7>6. 糖膜等多孔水凝胶膜固定的分子信标微阵列是一种具有良好应用前景的非标记检测技术。7. 研究并比较了溶液中和固定化的核酸探针解链曲线。 相对于溶液中的解链曲线,固定化的核酸探针的解链曲线被大大展宽和压低了,导致杂交后完全匹配和单碱基错配探针荧光信号的差值明显降低,影响了从单幅荧光图象判断杂交结果的可靠性。8. 研究了基于生物芯片的非平衡解链曲线分析方法及其在肝癌相关的乙肝病毒突变检测中的应用。选择了一组GC 含量差别较大(29.4 %至64.7 %)核酸探针,制备了乙肝病毒突变检测微阵列,通过非平衡解链曲线分析,得到了可靠的杂交结果。总结本论文工作,第一
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全文目录
第一章 绪论 13-23 1.1 生物芯片技术概述 13-19 1.2 本文的目的及结构 19-23 第二章 分子信标芯片的制备 23-51 2.1 分子信标 23-29 2.2 氨基修饰分子信标的设计 29-34 2.3 生物芯片基底 34-36 2.4 不同材料的修饰、活化及特性 36-44 2.5 分子信标微阵列的制备 44-50 2.6 小结 50-51 第三章 分子信标微阵列的杂交 51-81 3.1 仪器及软件 51-52 3.2 分子信标微阵列的复性 52-56 3.3 分子信标微阵列的杂交 56-65 3.4 分子信标微阵列的杂交反应动力学 65-79 3.5 小结 79-81 第四章 分子信标微阵列的应用 81-93 4.1 Escherichiacoli O157:H7毒力因子的鉴定 81-86 4.2 人类载脂蛋白(Apolipoprotein E)的基因分型 86-92 4.3 小结 92-93 第五章 基于生物芯片的解链曲线分析方法及其在单碱基错配识别中的应用 93-114 5.1 解链曲线分析方法 93-96 5.2 仪器及软件 96-98 5.3 溶液中及生物芯片上的解链曲线 98-107 5.4 非平衡解链曲线在HBV突变检测中的应用 107-113 5.5 小结 113-114 第六章 总结 114-117 参考文献 117-129 发表论文 129-131 致谢 131
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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体生物化学、分子生物学
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