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丙型肝炎病毒准种感染与干扰素疗效关系的研究

作　者: 张琳
导　师: 赵桂珍
学　校: 中国医科大学
专　业: 内科学
关键词: 丙型肝炎病毒准种 HVR1 NS5A ISDR RNA含量干扰素治疗
分类号: R512.6
类　型: 博士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

目的丙型肝炎病毒(HCV)在人体内以准种的形式存在。HCV准种感染是导致丙型肝炎慢性化和影响干扰素疗效的重要原因之一。本研究分别对应用干扰素治疗的慢性丙型肝炎患者HCV基因组中高变区1(HVR1)和非结构区5A(NS5A)进行了准种检测，以探讨HCV准种感染与干扰素疗效之间的关系，是否可以对干扰素治疗进行疗效预测，以及HCV准种异质性与HCV RNA含量之间的相互关系，为临床选择应用干扰素抗病毒治疗适应症及预测疗效提供理论依据。材料与方法研究对象：应用干扰素治疗的HCV RNA阳性的慢性丙型肝炎患者共20例，男15例，女5例。年龄23-45岁。干扰素治疗方案：α-干扰素3MU，3次／周肌肉注射，共24周。疗效判定：治疗结束时，ALT正常、HCV RNA阴转为暂时应答；ALT正常、HCV RNA阴转持续至治疗结束6个月以上为持续应答，否则为无应答。留取治疗前血清，-70℃冻存备用。 HCV HVR1及NS5A基因片断扩增：采用巢式逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)。分别在HVR1及NS5A两侧保守区设计PCR引物。首先应用常规的HCV RNA提取方法—异硫氰酸胍-酚-氯仿提取法从血清中提取HCV RNA，然后经过逆转录及两轮PCR反应，扩增出HVR1及NS5A区基因片断。 HCV基因分型：分别采用型特异性PCR法及核苷酸序列测定法。型特异性PCR法为在C区设计公共的上游引物及4条型特异性下游引物，进行RT-PCR扩增，依据PCR产物电泳结果直接区分HCV四种基因型。核苷酸序列测定法：应用直接测序法对NS5A区进行核苷酸序列测定，依此进行基因型的划分。 HVR1区准种异质性检测：采用克隆测序法。HVR1区PCR阳性产物纯化后，与载体质粒进行连接，然后转化到感受态大肠杆菌中，通过培养选择阳性菌落，每份标本挑取10个阳性克隆，进行重组质粒提取，经PCR验证后进行核昔酸序列测定。 NSSA区准种检测：采用直接测序法。NSSA区 PCR阳性产物纯化后，直接进行核谷酸序列测定。 HCV RNA定量检测：应用特异性荧光探针PCR法。采用PCR方法结合荧光探针的扩增检测技术，通过检测PCR反应体系中荧光强度的变化，并根据纯化HCV RNA建立标准曲线，即可推算出样本中 HCV RNA含量。实验结果 1．HVRI及 NSSA基因片断的扩增经RT－PCR扩增的HCV HVRI及NSSA 基因片断大小分别为388hP和573hp，电泳结果见图1。 2．HCV基因分型 20例患者应用型特异性PCR法分型结果为：DO）型14例（7％X皿p叫型4例＊0％XJ和皿混合型2例O％八电泳结果见图2。对上述患者中 12例 11型患者应用直接测序法进行了分型，结果 12例 11型患者中除1例为k型外，其余均为几型（见图3人两种检测方法一致性为gi．7阮。 3．HVRI准种异质性与干扰素疗效的关系对7例几型患者进行了克隆测序，其中3例为持续应答者／例为无应答者。每份血清挑取10个阳性克隆，共获得了63个克隆的序列，氨基酸序列结果见图4。HVRI准种的复杂性（准种数）在无应答组明显高于持续应答组＊＝6．737，P＜0．ofL见表 1。HVRI准种基因的差异性（nucleohdediversity）以每个基因位点的平均变异率来表示。无应答组平均每个位点的核昔酸及氨基酸变异率均明显高于持续应答组，见表2。 4．fo型 HCVNSSA基因变异与干扰素疗效的关系 NS5A2209－2248区核苛酸序列分析Jl例fo型患者干扰素治疗前核昔酸序列情况见表4。其中3户号患者为持续应答者，余为无应答者，两组之间核耷酸变异数无显著差异＊＝0．86，P＞0．05人与 HCV＊相比，变异数未超过10％，且多为同义突变，表明NSSA区高度保守。 NSSA。0。s区氨基酸序列变异与于扰素疗效的关系：按照Enomoto的分型方法，11例fo型患者豆例为中间型，余均为野生型，未见突变型。 fZ·NSS A。队。区氨基酸序列变异与于扰素疗效无关。结果见图 5。干扰素治疗对 NSS A基因变异的影响：对 5号患者的动态观察发现，于扰素治疗后NSSA基因发生了变异，导致其在基因树中位置改变。（图3中5刁j－义5－3X即引起了其准种的改变，并未导致基因型的变化。核昔酸变异大多为同义突变。氨基酸变异情况见图6。 4．HCV准种复杂性与HCV RNA含量的关系 HCV准种复杂性与 HCV RNA含量无显著相关性卜＝0．432，p＞0．05），见表3。结论 1．沈阳地区慢性丙型肝炎患者以感染 fo型 HCV为主。应用型特异性PCR法与核昔酸序列测定法所得的结论基本一致。 2．HCV HVRI区准种异质性（包括复杂性与基因的差异性）与干扰素疗效有关，异质性程度越高对干扰素无应答的可能性越大。 3．HCV NSSA基因片断具有高度保守性，NSSA＿．＿区氨基酸变异与干扰素疗效无关。在中国丙型肝炎患者中是否存在所谓的干扰素敏感决定区门SDR）有待进一步探讨。 4．HVRI准种的复杂性与HCV RNA含量无明显相关性，是预测干扰素疗效的独立因素之一。

全文目录

一、中文摘要  3-6
二、英文摘要  6-10
三、英文缩略语  10-11
四、前言  11-14
五、论文一  14-19
六、论文二  19-27
七、论文三  27-32
八、本研究创新点  32-33
九、参考文献  33-38
十、致谢  38-39
十一、论文综述  39-53
十二、个人简介  53-54
十三、在学期间发表论文  54

丙型肝炎病毒准种感染与干扰素疗效关系的研究

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