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HCV感染者免疫状况、病毒基因变异与疾病转归的相关性研究

作　者: 张萍
导　师: 陈智
学　校: 浙江大学
专　业: 内科学
关键词: HCV 基因分型准种变异 HVR1 抗原表位
分类号: R512.6
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

丙型病毒性肝炎是一种危害严重，影响广泛的疾病，丙型肝炎病毒为输血后肝炎的主要病因。探讨HCV的病原学特征，发病机理及研制诊断试剂及疫苗都要求对病毒基因一级结构有深入的了解。HCV呈现高度的基因异质性，变异分布在全基因组，不同的区域频率不一样，5’端非翻译区(5’UTR)最保守，许多商业试剂的开发都是用此区段作为检测HCV存在、定量和分型的基础。另外5’UTR大部分区域和核心蛋白(C)区的前30个核苷酸(nt)共同构成了IRES结构，介导了HCV的翻译，因此此区又可作为抗病毒药物设计的靶点。胞膜区2(E2)是全基因组变异最大的区域，在其N端第1-27个氨基酸(aa)及随后的第91-97aa高度可变，分别称之为高变区1(HVR1)，高变区2(HVR2)，其氨基酸多样性分别达到80％和100％，是最为常用的检测准种的区域。本文用PCR扩增产物直接测序的方法对中国大陆部分地区的流行株进行基因分型，从基因、分子水平分析我国的HCV流行株基因异质性特点及可能的原因，探讨其与疾病进展的关系。用RT-nested-hot start-PCR方法扩增5’UTR序列，产物纯化后自动测序仪测序，按照Stuyver L的方法对5’UTR内的7个信息区进行分析确定基因型。将得到的序列与标准株比较，分析这些地区的HCV流行趋势和分布特征。发现在我国的浙江、江苏、新疆，这三个省的HCV感染者有1a，1b，2a，1e，四种基因型存在。总体看，我国这三个地区存在的基因型以1b为主；HCV感染者的性别分布有明显的差异，男性明显高于女性；各型间HCV的年龄分布无明显差别；肝功能异常发生率1b型明显高于其它型别。基本上符合以前报道的，我国大陆地区以1b型为主，不同地区呈现南北差异，南方1b型占绝大多数，北方1b型为主，由南向北2a／Ⅲ型逐渐增多的趋势。对确定基因型的标本，选择不同地区，不同疾病背景的1b／Ⅱ，2a／Ⅲ共9份标本，用RT-nested-hot start-PCR方法扩增包含HVR1的部分E1+E2基因片段，直接与pGEM-T easy载体连接，再转化TOP10F’感受态细胞，经PCR法证实为阳性克隆后，质粒抽提，用全自动序列分析仪测序。每个标本挑选15个克隆，分析HVR1内的核苷酸和氨基酸序列，分析进化距离，进行准种多样性和复杂性分析，探讨其与疾病进展的关系，预测可能存在的免疫位点。发现高变区有80％的氨基酸位点发生变异，氨基酸水平上不同分离株与CCS的同源性在42％-60％之间，而且错义突变明显多于无义突变。第385T(苏)，390G(甘)，403F(苯丙)，406G，和409Q(谷氨酰胺)高度保守，可能与维持空间构型有关。病毒准种的多样性和复杂性与病浙江大学博士学位论文毒高复制状态，与感染时间相关，准种的异质性与肝损害程度无关，随感染时间的延长，机体的免疫状态可能处于比较低下的状态。准种的演变不仅是机体阳性选择压力的结果，也有阴性选择的参与，即随机突变积累的结果。HVRI区含有CTL、CD4+T细胞的抗原表位，这在不同的基因型、不同的优势序列间不完全一致。

全文目录

英文缩略词  4-6
所用实验试剂和仪器  6-9
前言  9-12
第一部分 HCV 基因分型、准种特点和抗原表位预测  12-38
  摘要  12-16
  第一节不同地区HCV感染者的基因型分析  16-22
  第二节中国大陆病人HCV分离株HVR1区准种特点分析及免疫位点预测  22-36
    引言  22-23
    材料和方法  23-29
    结果  29-31
    讨论  31-35
    结论  35-36
  参考文献  36-38
第二部分中国部分地区HCV感染者免疫状况分析及对疾病的转归影响  38-63
  摘要  38-42
  材料和方法  42-43
  结果  43-56
  讨论  56-60
  结论  60-61
  参考文献  61-63
附图  63-83
文献综述  83-102
在读期间发表的文章  102-103
后记  103-105
致谢  105

HCV感染者免疫状况、病毒基因变异与疾病转归的相关性研究

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