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丙型肝炎病毒抗体化学发光检测方法的建立及临床应用

作　者: 牛小斌
导　师: 李付广；杜英
学　校: 郑州大学
专　业: 免疫学
关键词: 化学发光丙型肝炎病毒检测酶联免疫吸附试验建立
分类号: R512.63
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

背景与目的:丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)是引起输血后病毒性非甲非乙型肝炎的主要病原,主要通过输血、静脉吸毒途径传播,也可通过密切接触和母婴传播。目前全世界约有1.7亿HCV感染者,预计我国感染者不低于4000万人。受感染者中约有一半可发展为慢性肝炎,进而部分可发展为肝硬化和肝细胞性肝癌。目前,尚无有效的丙型肝炎预防疫苗及治疗药物,因此对HCV感染的早期诊断是有效控制丙型肝炎病毒传播的重要手段。目前,HCV感染的实验室诊断技术主要有血清HCV RNA、抗HCV抗体及HCV抗原检测。聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测HCV RNA是目前HCV感染诊断最灵敏、最特异的方法,但其操作比较复杂,易造成污染,且价格昂贵,不适于大规模的筛查。HCV感染患者血清中的抗原水平很低,常规的免疫学、病毒学方法难以获得阳性结果;因此,血清HCV抗原检测尚不能作为一种实验室的常规检测手段。抗HCV检测是HCV感染的主要证据之一。目前,临床应用最多的方法仍是以检测血清抗HCV为主,而普遍采用的酶免疫的检测方法,对于低水平人群容易造成漏检;在国外化学发光法因其灵敏度高,已经成为主要的检测方法,而国内在化学发光法检测抗HCV上基本还属于空白。因此,用化学发光法检测抗HCV对进一步提高抗HCV检测水平有重要意义。本文采用化学发光酶免疫分析(Chemiluminescence enzyme immunoassay,CLEIA)的原理检测人血清中的抗HCV抗体。方法:1采用改良过碘酸钠法将辣根过氧化物酶标记到抗人IgG上,并配制成酶标抗体工作液:用pH9.6的碳酸盐缓冲液将丙型肝炎病毒融合抗原(含CORE、NS3、NS4、NS5)包被于化学发光微孔板上,并优化其最佳工艺;建立抗HCV化学发光酶免疫分析检测体系,确定加样模式、洗涤方式、反应温度、反应时间、测定时间。2通过检测国家和国际标准品,评价该方法的灵敏度、特异性等性能指标;观察常见的抗凝剂、特殊人群血清等对本方法测定性能的影响;并和进口ELISA试剂盒进行临床对照。结果:1确立了化学发光包被板的包被方法:采用国产微孔板;包被液和包被方式为0.05 mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6),100μl/孔,4℃过夜,抗原包被浓度为1μg/ml;封闭液为0.01 mol/L PBS(pH7.4,含1%BSA和5%蔗糖),封闭方式为4℃过夜。建立了抗HCV化学发光检测体系:100μl样本稀释液加10μl样本,37℃反应30min,沈板6次,加1:4000稀释的酶标抗体100μl/孔,37℃反应30min,洗板6次,加入发光底物A、B各25μl,在10～15min内检测发光值。2本方法的分析灵敏度为0.1NCU/ml。抗HBs阳性、抗核抗体阳性、多发性骨髓瘤患者、孕妇及婴幼儿、抗HIV阳性血清对本方法无干扰;含胆红素、胆固醇、甘油三酯血清标本在一定范围内不会对检测结果产生影响;常用的抗凝剂不会对检测造成干扰。本方法在检测中国药品生物制品检定所的HCV抗体国家参考品时,阳性检出率优于国产ELISA试剂盒,在检测美国BBI血清转化盘时,和ELISA国产试剂盒相比,能明显缩短HCV抗体阳性检出的窗口期,和进口ELISA试剂盒相当。结论:建立的化学发光法检测抗HCV的方法,灵敏度高、特异性强、稳定性好,有良好准确性和重复性,能明显缩短抗HCV阳性检出的窗口期,和进口ELISA试剂盒相当。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-8
论文部分丙型肝炎病毒抗体化学发光检测方法的建立及临床应用  8-38
  前言  8-9
  材料与方法  9-17
    1 实验材料  9-11
    2 方法  11-17
  实验结果  17-33
  讨论  33-35
  小结  35
  参考文献  35-38
综述丙型肝炎病毒实验室检测的进展  38-50
  参考文献  45-50
英文缩略词表  50-52
在校期间发表文章  52-54
致谢  54

丙型肝炎病毒抗体化学发光检测方法的建立及临床应用

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