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以DNA为基础的复合免疫接种诱导小鼠抗AMA1免疫应答

作　者: 李珣
导　师: 薛采芳
学　校: 中国人民解放军第四军医大学
专　业: 病原生物学
关键词: 恶性疟原虫 顶端膜抗原1 DNA疫苗 MVA 免疫应答
分类号: R392
类　型: 博士论文
年　份: 2003年
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内容摘要


疟疾仍然是危害人类健康的严重传染病，有效的疫苗将为防止疟原虫感染、减少疟疾发病和阻断蚊媒传播提供重要的手段。DNA疫苗是一种全新的疫苗形式，具有简单、稳定和灵活多样的突出特点，可诱导包括细胞和抗体在内的多种免疫应答。细胞因子在免疫应答过程中具有重要的作用，编码细胞因子的质粒DNA可有效促进和调节DNA疫苗所诱导的免疫应答。用DNA进行初始免疫，用重组蛋白或重组减毒痘病毒进行追加免疫的初始／强化免疫方案可选择性地增强由DNA免疫所诱导的免疫应答，提高DNA疫苗的保护效能。AMA1是红内期疟疾疫苗的重要候选抗原，抗体在针对AMA1的保护性免疫中发挥着关键作用。本研究选择AMA1的胞外域片段作为疫苗靶向，制备了包括重组蛋白、质粒DNA和重组MVA在内的三种不同形式的原型疫苗，在分析各种疫苗免疫特性的基础上，采用DNA加细胞因子编码质粒进行初始免疫，用重组蛋白和重组MVA按不同的顺序进行追加强化，探讨了不同免疫方案在增强小鼠抗AMA1抗体应答中的作用。 首先，自P.f基因组DNA中扩增出编码AMA1胞外域的基因片段，经测序确证后，克隆入原核表达载体。构建了可分别表达AMA1完整胞外域蛋白和不同亚结构域蛋白的系列重组表达载体，包括：pET-16b／E、pET-16b／Ⅰ+Ⅱ、pET-16b／Ⅰ、pET-30a(+)/Ⅱ和pET-30a(+)/Ⅲ。转化E.coli BL21DE3菌，经诱导后表达出各个重组蛋白。用变性剂溶解包涵体蛋白，经Ni-NTA琼脂糖纯化后在适宜的条件下进行重折叠复性。用重组蛋白加福氏佐剂经腹腔接种免疫BALB／c小鼠，制备抗血清，采用免疫荧光和免疫印迹的方法鉴定抗血清的识别特性，用小鼠免疫血清进行疟原虫体外生长抑制实验，分析重组蛋白与保护性抗体应答之间的关系。结果表明，AMA1胞外域蛋白结构的完整性对于保护性抗体的诱导至关重要。 在蛋白免疫实验的基础上，本文选择编码AMA1完整胞外域的基因片段，构建了DNA免疫质粒VR1020／E。用100μg的剂量经肌肉接种BALB／c小鼠，两次免疫后，诱导出明显的AMA1特异的抗体和脾细胞增殖。构建小鼠细胞因子表达质粒pcDNA3／GM-CSF和pcDNA3.1(-)／IL-4，以及双表达质粒pGM-CSF／pTPA-E,用细胞因子表达质粒分别与VR1020／E共同免疫小鼠，分析细胞因子质粒对AMA1 DNA免疫的调节作用。结果表明，各种细胞因子质粒均显著促进了小鼠针对AMA1的抗体和细胞应答，第四军医大学博士学位论文 摘要GM（SF质粒和IL人 质粒分别显著促进了ThZ型和hl型的免疫应答。 MVA是高度减毒的痘苗病毒株，利用重组MVA可诱导针对多种病原体和肿瘤细胞的免疫应答。本文构建了基因转移载体 pllldHR．SSpffi，经同源重组后筛选获得可稳定表达AMAI蛋白的重组病毒dAVVE。用＊～108TCID”剂量的rMVMi经腹腔接种BALB／c ’J’鼠，三次免疫后诱导出明显的抗体和脾细胞应答，其抗体应答以IgGZa为主，表明tMWIN诱导了hl型的免疫应答。 在对三种AMAI原型疫苗的免疫特性进行逐一分析的基础上，本文首先采用h4VA／E对不同质粒DNA免疫组的小鼠进行了追加强化，结果显示，dAVAi可显著增强DNA免疫所诱导的AMA抗体应答，在提高IgG水平的同时，更加显著地促进了小鼠的lgGZa应答。同时发现，DNA初始免疫的应答水平、应答类型以及免疫间隔时间对病毒强化免疫的效果具有一定的影响。初始应答的抗体水平与强化免疫后的抗体水平呈正相关。由GM（SF表达质粒诱导的ThZ型应答在病毒强化后依然占据主导，而由IL－12表达质粒诱导的hl型应答在病毒强化后则得到了进一步的加强和巩固。较长的免疫间隔有利于产生更高水平的回忆性抗体，同时也更加倾向于病毒所诱导的免疫应答即hl型应答。 在进一步的实验中，本文采用 VR1020N加 GM．CSF表达质粒对小鼠进行了初始免疫，而后用重组蛋白和重组MVA按不同的先后顺序进行了组合强化免疫，对比分析不同免疫强化方案在增强小鼠抗体应答中的作用。结果表明，重组蛋白E加福氏完全佐剂和rMVA／E可同样显著地强化DNA诱导的抗体应答，蛋白强化更加显著地促进了IgGI类抗体，病毒强化则更加显著地促进了IgGZa类抗体。重组蛋白E加福氏完全佐剂在fAVAjE强化的基础上进一步提高了小鼠的IgG水平，并显著地增强了IgGZa应答。 以上研究结果为探索以AMAI为应用抗原的红内期疟疾疫苗的最佳免疫方案提供了实验基础。

全文目录


目录  4-7
英文缩写词注  7-11
摘要  11-16
前言  16-18
研究内容  18-62
  第一部分 重组AMA1蛋白的制备及其诱导的小鼠抗体应答  18-31
    一 材料与方法  18-21
      1 疟原虫的培养和基因组DNA的提取  18-19
      2 引物设计和PCR  19
      3 重组表达载体的构建和序列测定  19-20
      4 质粒和菌种  20
      5 重组表达产物的溶解性实验  20
      6 包涵体蛋白的纯化  20
      7 变性蛋白的重折叠复性  20-21
      8 小鼠免疫和抗体的检测  21
      9 IFA和Western blot  21
      10 免疫血清的体外抑制实验  21
    二 结果  21-29
      1 AMA1胞外域编码基因的扩增和序列分析  22-24
      2 重组AMA1蛋白的表达和纯化  24-27
      3 小鼠免疫血清的制备以及体外抑制实验  27-29
    三 讨论  29-31
  第二部分 细胞因子质粒对AMA1 DNA免疫的调节作用  31-44
    一 材料与方法  31-33
      1 AMA1 DNA免疫质粒的构建  31-32
      2 GM-CSF编码序列的测定和表达载体的构建  32
      3 IL-4编码序列的测定和表达载体的构建  32
      4 IL-12编码质粒的酶切鉴定  32
      5 双表达质粒pGM-CSF／pTPA-E的构建  32
      6 质粒的纯化  32-33
      7 AMA1 DNA免疫的抗体动力学分析  33
      8 细胞因子质粒与VR1020／E的组合免疫  33
      9 脾细胞增殖实验  33
    二 结果  33-42
      1 AMA1 DNA免疫质粒的构建  33-34
      2 小鼠细胞因子编码序列的测定和表达质粒的构建  34-37
        2.1 小鼠细胞因子GM-CSF的序列分析和载体构建  34-35
        2.2 小鼠细胞因子IL-4的序列测定和载体构建  35-36
        2.3 pIL-12的酶切鉴定  36
        2.4 双表达质粒pGM-CSF／pTPA-E的鉴定  36-37
      3 细胞因子对AMA1 DNA免疫的调节作用  37-42
        3.1 AMA1 DNA免疫的抗体动力学  37
        3.2 细胞因子表达质粒对DNA免疫应答的调节作用  37-42
          3.2.1 IgG抗体的水平和类型  37-40
          3.2.2 脾细胞的体外增殖  40-42
    三 讨论  42-44
  第三部分 表达AMA1的重组MVA的筛选及小鼠免疫  44-54
    一 材料与方法  44-47
      1 基因转移载体pⅢdHR.ssp/E的构建  44-45
      2 AMA1转移载体与MVA的同源重组  45
      3 重组MVA的筛选  45
      4 重组MVA的鉴定  45-46
      5 重组病毒的扩增和滴度测定  46-47
      6 小鼠的免疫  47
    二 结果  47-52
      1 AMA1基因转移载体的构建  47-48
      2 表达AMA1的重组MVA的筛选和鉴定  48-50
        2.1 MVA重组体的PCR鉴定  48
        2.2 AMA1在BHK21中的表达  48-50
        2.3 重组病毒rMVA/E的稳定性  50
      3 重组MVA的免疫特性分析  50-52
        3.1 rMVA／E诱导小鼠抗AMA1抗体应答  50
        3.2 rMVA／E免疫小鼠的脾细胞增殖  50-52
    三 讨论  52-54
  第四部分 以DNA为基础的复合免疫接种诱导小鼠抗AMA1抗体应答  54-62
    一 材料与方法  54-55
      1 rMVA/E对DNA免疫小鼠抗体应答的增强作用  54
      2 重组蛋白强化与重组MVA强化的比较以及组合强化免疫  54-55
    二 结果  55-60
      1 rMVA／E对DNA免疫小鼠抗体应答的增强作用  55-57
      2 重组蛋白E与rMVA／E抗体强化作用的比较以及组合强化的效果  57-60
    三 讨论  60-62
小结  62-63
文献回顾  63-79
  一 DNA免疫的机制和优化方法  63-72
  二 改良的安卡拉痘苗病毒(MVA)及其应用  72-76
  三 疟原虫顶端膜抗原1(AMA1)的研究概况  76-79
参考文献  79-95
致谢  95-96
附录: 研究生期间发表的论著  96

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学
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