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中国猪瘟兔化弱毒（脾淋毒）全长感染性cDNA的分子克隆

作　者: 胡建和
导　师: 张彦明
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 中国猪瘟兔化弱毒 cDNA文库基因组序列同源性比较全长cDNA T-A克隆多片段一步连接法分子克隆体外转录转染感染性鉴定
分类号: S852.65
类　型: 博士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

中国猪瘟兔化弱毒（脾淋毒）全长感染性cDNA的克隆和构建，可以使我们得到纯粹的CSFV C-株RNA病毒基因组，在DNA水平上研究和利用CSFV的基因突变、缺失、插入和替换。为进一步研究CSFV的复制机理、毒力及其决定因素、致弱机制、致病机理、基因产物的功能、特异性诊断、宿主嗜性以及DNA疫苗开发、标记疫苗的生产等方面的研究，打下了坚实的基础，并为众多病毒分子生物学研究工作者提供极为有价值的研究工具。主要研究内容包括： 1．中国猪瘟兔化毒（脾淋毒）基因组cDNA文库的构建、序列分析：根据已发表的猪瘟病毒（CSFV）核苷酸序列，借助计算机软件分析，选择高保守区段和基因组中的单一限制性酶切位点，利用RT-PCR及nested-PCR和Helf-nested PCR技术，成功地扩增出了覆盖C-株全基因组的7个cDNA重叠片段F1～F7，分别克隆到pMD-18T或pGEM-T Easy载体进行测序后，拼接出了其核苷酸序列。与国内外已发表的CSFV Shimen株、Berscia株、Cap株、Eystrup株、F114株、Glentorf株、Riems株、Russia C株和Alfort株进行了序列比较。 2．中国猪瘟兔化毒（脾淋毒）全长-cDNA的分子克隆：通过基因改造，将T7 RNA聚合酶启动子和目的片段连接过程中起辅助作用的限制性内切酶识别位点各自导入相应的cDNA重叠片段末端。将F3、F4 PCR产物，采用Acc Ⅲ酶切后与pMD-18T载体置同一体系中连接，获得连接片段F3-F4的重组质粒pMD-18T／F34。再将重组质粒pMD-18T／F1采用NotⅠ和PvuⅠ双酶切，重组质粒pGEM-T Easy／F2采用PvuⅠ和NsiⅠ双酶切，重组质粒pMD-18T／F34采用NsiⅠ和SalⅠ双酶切，载体pGEM-5zf（+）采用NotⅠ和SalⅠ双酶切，分别回收各目的片段，于同一体系中连接，获得5′半长cDNA重组质粒pGEM-5zf（+）／F1-4，长度为6517bp。将重组质粒pMD-18T／F5采用NotⅠ和FspⅠ双酶切，重组质粒pMD-18T／F6采用FspⅠ和Csp45Ⅰ双酶切，重组质粒pMD-18T／F7采用Csp45Ⅰ和SalⅠ双酶切，载体pGEM-5zf（+）采用NotⅠ和SalⅠ双酶切，分别回收各目的片段，于同一体系中连接，获得3′半长cDNA重组质粒pGEM-5zf（+）／F5-7，长度为5940bp。最后，将重组质粒pGEM-5zf（+）／F1-4采用NotⅠ和SplⅠ双酶切，重组质粒pGEM-5zf（+）／F5-7采用SplⅠ和SalⅠ双酶切，载体pGEM-5zf（+）采用NotⅠ和SalⅠ双酶切，分别回收各目的片段，于同一体系中连接，得到基因组全长cDNA重组质粒pGEM-5zf（+）／F1-7。T-A克隆的巧妙运用和多片段一步连接法的成功运用是全长cDNA得以快速构建的主要原因。 3．中国猪瘟兔化毒（脾淋毒）全长cDNA感染性的初步鉴定：利用限制性内切酶SrfⅠ将重组质粒pGEM-5zf（+）／F1-7线性化，以产生精确的基因组3′末端。以线性化的全长cDNA为模板，体外转录得到了CSFV基因组RNA。采用TransFast^TM Reagent脂质体转染试剂将基因组RNA转染到SK-6贴壁细胞。连续传代5代以后，收集各W摘要代细胞至第10代，采用RT一PCR、直接荧光抗体染色和夹心ELISA技术进行鉴定，结果均为阳性。表明利用反向遗传技术，可以从猪瘟病毒C一株的基因组RNA获得C一株重组病毒。这一技术为众多病毒分子生物学研究领域提供了极为有价值的研究工具。

全文目录

前言  8-10
摘要  10-14
文献综述  14-48
  第一章猪瘟及猪瘟病毒的研究进展  14-36
    1.1 猪瘟的研究进展  14-20
      1.1.1 猪瘟概述  14-15
      1.1.2 猪瘟的流行和分布  15-16
      1.1.3 猪瘟的临床症状和致病机理  16-18
      1.1.4 猪瘟的检测  18-19
      1.1.5 猪瘟的防制  19
      1.1.6 猪瘟的传统疫苗  19-20
    1.2 猪瘟病毒的病原学特性及研究进展  20-30
      1.2.1 猪瘟病毒的形态及理化特性  20-21
      1.2.2 猪瘟病毒的基因组结构及研究进展  21-23
      1.2.3 猪瘟病毒的编码蛋白、抗原性及其功能  23-27
      1.2.4 猪瘟病毒的进化和遗传分型  27-30
    1.3 猪瘟病毒的增殖及细胞培养  30-36
      1.3.1 猪瘟病毒的入侵及增殖  30-31
      1.3.2 猪瘟病毒对宿主细胞的致病机理  31-32
      1.3.3 猪瘟病毒的细胞培养  32-36
  第二章新型猪瘟疫苗的研究和应用前景  36-41
    2.1 CSFV基因缺失型弱毒疫苗  36-37
    2.2 CSFV亚单位疫苗  37-38
    2.3 CSFV活载体重组疫苗  38-39
    2.4 CSFV DNA疫苗  39-40
    2.5 CSFV全长感染性cDNA标记疫苗  40-41
  第三章动物RNA病毒全长感染性cDNA的研究进展  41-48
    3.1 动物RNA病毒全长感染性cDNA的研究概况  41-47
    3.2 全长感染性cDNA的发展前景  47-48
实验研究  48-69
  第四章中国猪瘟兔化弱毒株全基因组cDNA文库的构建及核苷酸序列分析  48-57
    4.1 材料与方法  48-53
      4.1.1 种毒及病毒的扩增  48
      4.1.2 载体、试剂及引物的设计合成  48-50
      4.1.3 RT-PCR  50-51
      4.1.4 PCR产物的纯化回收  51
      4.1.5 PCR产物与pMD18-T载体的克隆  51
      4.1.6 大肠杆菌JM109感受态的制备  51-52
      4.1.7 连接产物的转化  52
      4.1.8 重组质粒的提取和鉴定  52-53
      4.1.9 基因组cDNA重叠片段的测序  53
      4.1.10 序列分析和同源性比较  53
    4.2 结果  53-55
      4.2.1 cDNA合成及PCR  53-54
      4.2.2 PCR产物的克隆及序列测定  54
      4.2.3 序列同源性比较  54-55
    4.3 讨论  55-56
    小结  56-57
  第五章中国猪瘟兔化弱毒(脾淋毒)全长cDNA的分子克隆  57-62
    5.1 材料与方法  57-59
      5.1.1 材料  57
      5.1.2 试剂与引物  57-58
      5.1.3 改造片段的PCR及重组克隆  58
      5.1.4 全长cDNA的克隆连接  58-59
    5.2 结果  59-60
      5.2.1 cDNA合成及PCR  59
      5.2.2 PCR产物的克隆及序列测定  59
      5.2.3 全长cDNA的克隆连接及鉴定  59-60
    5.3 讨论  60-61
    小结  61-62
  第六章中国猪瘟兔化弱毒(脾淋毒)全长cDNA的感染性初步鉴定  62-69
    6.1 材料和方法  62-64
      6.1.1 试验材料  62
      6.1.2 所用试剂及限制性酶  62
      6.1.3 全长cDNA模板的线性化和纯化回收  62-63
      6.1.4 基因组RNA的体外转录、模板去除、纯化及其鉴定  63
      6.1.5 基因组RNA的细胞转染及传代  63-64
      6.1.6 全长cDNA感染性的鉴定  64
    6.2 结果  64-67
      6.2.1 转录产物的RT-PCR和nested-PCR鉴定结果  64-65
      6.2.2 转染细胞总RNA的RT-PCR和nested-PCR鉴定结果  65-66
      6.2.3 转染细胞的直接荧光抗体染色鉴定结果  66-67
      6.2.4 转染细胞病毒抗原的夹心ELISA检测结果  67
    6.3 讨论  67-68
    小结  68-69
研究结论  69-71
致谢  71-72
参考文献  72-87
附录: 所测CSFV C-株(脾淋毒)核苷酸全序列酶标图  87-94
作者简介  94

中国猪瘟兔化弱毒（脾淋毒）全长感染性cDNA的分子克隆

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