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脂多糖交叉表位模拟肽的研究

作　者: 文维延
导　师: 富宁
学　校: 第一军医大学
专　业: 免疫学
关键词: 脂多糖交叉表位噬菌体随机肽库模拟肽合成肽硫氧还蛋白
分类号: R392.11
类　型: 博士论文
年　份: 2000年
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内容摘要

革兰氏阴性菌败血症是临床上最常见的致死原因之一，目前所使用的抗生素及对症支持疗法难以有效降低由GNB（Gram Negative Bacteria）败血症休克导致的病死率。细菌脂多糖（LPS）是造成革兰氏阴性菌败血性休克过程中病人多器官衰竭及死亡的重要始动因子，类脂A是其保守结构和毒力中心。迄今为止，虽有许多抗菌素可杀菌，但尚无理想的桔抗LPS或类脂A的制剂用于临床；虽然抗LPS抗体的保护性已是共识，且抗核心糖脂抗体的水平与败血症的生存率有关，但临床上应用抗体的时机难以掌握，而且异源性抗体的反复应用可导致变态反应的发生。因此，建立针对内毒素脂多糖的主动免疫是防治败血症休克的重要途径之一。但是，由于LPS属Ⅰ型非胸腺依赖抗原即TI-Ⅰ抗原，不能诱导高亲和力、调理杀菌力强的抗体以及有效的再次应答，加之LPS存在众多菌株及血清型特异性，这些均给研制有效的、具广谱保护性的疫苗带来困难。理想的疫苗所诱导产生的抗体应是亲和力高、调理杀菌力强，并具广谱预防作用。我们的目的是筛选可模拟LPS保守结构的多肽表位，其意义在于：（1）改变LPS保守结构的抗原性质，将脂多糖表位变为多肽表位，使TI抗原成为TD抗原，从而诱导有效的再次应答；（2）模拟LPS保守表位的多肽可望诱导针对不同革兰氏阴性菌及其LPS的交叉保护力，即广谱预防作用；（3）存在筛选到新型LPS拮抗剂的先导化合物的可能性。由于用针对LPS保守表位的抗体筛选，因此有可能筛选到可模拟LPS与其受体结合部位的短肽，而这类表位可与LPS竞争结合受体，即成为受体拮抗剂，至少是拮抗剂的先导化合物；我们首先利用经特殊处理的鼠伤寒杆菌T8-61（50220-1）制备了可与伤寒杆菌、大肠杆菌LPS及绿脓杆菌、布氏杆菌菌体反应的高效价的抗LPS交叉表位的单克隆抗体（该抗体具交叉保护性），并用该抗体对噬菌体肽库进行了筛选，目的是获得LPS交叉表位的模拟肽，以期为开发新型的、具TD抗原性质的抗LPS广谱疫苗莫定基础；同时探索将这类模拟肽作为LPS拮抗剂先导化合物的可能性。本研究分为以下四个部分。 1．第一部分：脂多糖及抗脂多糖交叉表位的抗体的制备和鉴定。制备了高纯度的、具有生物学活性的大肠杆菌及鼠伤寒杆菌LPS；同时通过乙酸煮沸法处理伤寒杆菌并免疫小鼠制备了能与大肠杆菌及伤寒杆菌LPS反应、且能与绿脓杆菌及布氏杆菌菌体反应的针对LPS 交叉表位的单克隆抗体 IB6，该抗体能保护小鼠抵抗致死剂量大肠杆菌的攻击：制备了具有交叉反应的抗大肠杆菌及伤寒杆菌LPS的多克隆抗血清。 2．第H部分脂多糖交叉表位模拟肽的筛选与鉴定。在此部分中，用针对乙PS交叉表位的单克隆抗体，对噬菌体随机 15肽库及 12肽库进行了筛选，经ELISA鉴定、DNA测序以及竟争抑制实验鉴定，获得了6种阳性噬菌体克隆，相应的展示肽序列为THSHQWRHHQFPAPT、 GPPQWFFSQPQL、LPQYFWNTATTA、FPQNHWNVPWAT、HSQSFWNAPLAM 及 AHPWTHGYFPPL。其中，THSHQWRHHQFPAPT、GPPQWFFSQPQL 和 FPQNHWNVPWAT噬菌体克隆可诱导小鼠产生抗LPS抗体。 3．第三部分LPS模拟肽的合成与鉴定：对保守性最强的阳性噬菌体展示 12肽 P1201（GPPQWFFSQPQ）序列进行了合成及抗原性鉴定。结果显示合成肽－KLH交联物可与＊抗体特异性地反应，并且合成肽可特异性地抑制 IB6抗体与伤寒杆菌 LPS、相应阳性噬菌体克隆与 IB6抗体的结合，提示GPPQWFFSQPQ合成肽具有LPS的抗原性。此外，用GPPQWFFSQPQ合成肽与KLH交联物免疫小鼠、以鉴定合成肽的免疫原性的工作正在进行之中。 4．LPS模拟肽在硫氧还蛋白系统中的克隆与表达：鉴于合成肽存在的成本高、某些序列的高度疏水性而至的可溶性差及体内半衰期短的问题，为了探索获得高活性、低成本的模拟肽的可能性，我们尝试将编码 P1201（GPPQWFFSQPQL）、P1202（LPQYFWNTATTA）阳性 12 肽的DNA序列导入大肠杆菌硫氧还蛋白的活性表位，鉴定硫氧还蛋白－阳性肽的内融合蛋白是否能作为合成肽的替代方式。PCR鉴定、 DNA序列分析以及蛋白电泳结果显示，编码短肽的DNA已准确无误地插入硫氧还蛋白相应部位，且已得到正确表达，但是，western blot 和ELISA鉴定结果却显示，融合蛋白并不具备相应噬菌体阳性肽的一7一LPS表位抗原性。论文中讨论了其可能的原因，即将短肽环化

全文目录

缩略语词表  3-6
中文摘要  6-9
英文摘要  9-13
前言  13-18
第一部分抗脂多糖交叉表位的抗体的制备和鉴定  18-30
  材料与方法  18-21
  结果  21-28
  讨论  28-30
第二部分：脂多糖交叉表位模拟肽的筛选与鉴定  30-52
  材料与方法  30-36
  结果  36-45
  讨论  45-52
第三部分： LPS模拟肽的合成与鉴定  52-59
  材料与方法  52-53
  结果  53-57
  讨论  57-59
第四部分：在硫氧还蛋白系统中的克隆表达  59-77
  材料与方法  59-70
  结果  70-74
  讨论  74-77
总结  77-79
参考文献  79-96
致谢  96-97
附录：学习期间发表的与本课题相关的论文  97-98
综述1：细菌内毒素的信号传递及抗内毒素的防治策略  98-110
综述2：碳水化合物的糖基表位模拟肽研究  110-116

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