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CD59基因W40位点突变、真核表达与生物学活性研究

作　者: 朱新红
导　师: 高美华
学　校: 青岛大学
专　业: 病原生物学
关键词: CD59 基因突变 补体 真核表达 Overlap extension PCR
分类号: Q78
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


目的采用基因点突变技术构建两种CD59突变基因并重组入真核表达质粒,通过转基因技术建立高效真核表达系统,观测细胞表面野生型CD59与突变型CD59分子的表达情况,探讨CD59抗补体活性变化,推断W40位点及邻近氨基酸的生物学活性,以初步揭示CD59分子在肿瘤逃逸中的作用,为肿瘤免疫治疗提供理论依据。方法选取物种间高度保守W40位点基因及相邻碱基为突变位点,构建两种不同的基因突变,一种是编码W40的密码子TGG缺失突变(M1),另一种是C39W40K41→W39W40W41的相应基因突变(M2),采用Overlap extension PCR法诱导CD59点突变,各设计两条常规引物和两条反向互补突变引物,以已构建CD59cDNA为模板,3重PCR定点诱变扩增突变基因,重组入克隆载体PMD18-T-Vector,EcoRⅠ单酶切后,突变基因重组入真核表达载体pIRES。利用阳离子脂质体(Lipfectamine2000)将重组质粒转染中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO)进行表达。G418筛选稳定转染细胞克隆,核酸原位杂交检测CD59mRNA的表达,荧光免疫组化、酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫印迹技术检测筛选CD59突变基因蛋白高表达株,染料释放试验与台盼蓝染色试验检测和比较野生型与突变型CD59蛋白抗补体活性的不同。结果通过PCR定点诱变成功获得目的CD59突变基因,序列测定及酶切鉴定均证实成功构建了pIRES-M1CD59、pIRES-M2CD59重组真核表达载体系统,突变基因长度约500bp。核酸原位杂交显示CD59mRNA的表达,免疫荧光、ELISA、Western-blot验证CD59的表达,传代30代,仍可测到蛋白表达;荧光染料释放试验和台盼蓝染色试验研究显示与野生型CD59相比,突变型M1CD59失去对补体的抑制功能,而突变型M2CD59对补体的抑制作用较强。结论:1.采用基因点突变和基因重组技术成功构建两种突变CD59重组质粒。2.通过转基因技术将重组质粒pIRES-M1CD59和pIRES-M2CD59导入CHO细胞,建立稳定真核表达系统。3.CD59的W40位点是CD59分子重要的抗补体活性位点,提示封闭此位点可提高补体活性,有望用于肿瘤靶向治疗。

全文目录


摘要  2-4
Abstract  4-8
引言  8-12
第一章 材料和方法  12-33
  1.1 材料  12-13
    1.1.1 主要仪器设备  12
    1.1.2 质粒、菌株与细胞株  12
    1.1.3 主要实验试剂及配制方法  12-13
  1.2 方法  13-33
    1.2.1 目的基因的选择及引物设计  13-16
    1.2.2 目的基因的获得及纯化  16-18
    1.2.3 克隆载体构建及鉴定  18-22
    1.2.4 真核表达质粒的构建  22-25
    1.2.5 细胞转染及稳定转染细胞系的建立  25-27
    1.2.6 稳定转染细胞阳性克隆的筛选  27-31
    1.2.7 突变CD59分子抗补体活性检测  31-33
第二章 结果  33-52
  2.1 突变CD59基因的克隆与鉴定  33-34
  2.2 克隆载体的构建与鉴定  34-35
  2.3 重组表达载体构建与鉴定  35-38
  2.4 正常中国仓鼠卵巢细胞(CHO)的培养  38-39
  2.5 重组基因转染CHO细胞的筛选  39-41
  2.6 阳性重组克隆在CHO细胞的表达  41-46
    2.6.1 荧光免疫结果  41-42
    2.6.2 CD59寡核苷酸探针原位杂交鉴定阳性细胞克隆  42-43
    2.6.3 SDS—PAGE检测结果  43-44
    2.6.4 免疫印迹技术(Western-blot法)鉴定突变CD59分子的表达  44-45
    2.6.5 固相酶联免疫吸附试验(ELISA)检测CD59分子的表达  45-46
  2.7 突变人CD59生物学活性的检测结果  46-52
    2.7.1 台盼蓝染色试验结果  46-50
    2.7.2 染料释放试验结果  50-52
第三章 讨论  52-58
结论  58-59
参考文献  59-61
综述  61-89
  综述的参考文献  81-89
博士研究生期间第一作者发表的文章  89-90
附录  90-101
致谢  101-102

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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