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蛇根木Perakine还原酶的表达、酶特征研究、定点突变、结晶及三维结构

作　者: 孙莲莉
导　师: 赵昱；Joachim Stoeckigt
学　校: 浙江大学
专　业: 药物分析学
关键词: Perakine还原酶醛酮还原酶功能性表达吲哚生物碱次生代谢网络蛇根木(夹竹桃科) 酶结晶氧化还原酶三维结构
分类号: R284
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

夹竹桃科萝芙木属药用植物蛇根木（Rauvolfia serpentina Benth.ex Kurz）有降血压、抗心律失常、退热、抗癫、治虫蛇咬伤等功效,富含生物碱类化合物,其主要活性成分为阿吗灵、阿吗碱和利血平。对其次生代谢产物生物合成网络的研究是进一步开发利用该药用植物、调控生物代谢方向、体外异源表达活性成分的基础。本论文对催化蛇根木生物碱Perakine还原为Raucaffrinoline反应的Perakine还原酶（Perakine Reductase,PR）进行了一系列的研究,主要包括该酶的表达、生化特征、结晶和三维结构。论文的第一部分对Perakine还原酶的生物化学特征进行了研究。以pQE-2质粒为表达载体,在大肠杆菌M15中异源高效表达N端带有6个组氨酸标记的PR,并利用Ni-NTA亲和层析进行纯化。PR的底物特异性相对较低,在所测试的30个带有可还原性羰基化合物（主要为苯甲醛类衍生物、桂皮醛类衍生物及类单萜吲哚生物碱）中有17个化合物可被PR转化,但PR对类单萜吲哚类生物碱显示了很强的底物特异性。PR特异性地依赖NADPH/NADP⁺作为辅酶进行氧化还原反应的催化。氨基酸序列比对结果表明,PR为醛酮还原酶（aldo-keto reductase,AKR）超家族的新成员,具有AKR超家族成员高度保守的四个特征性氨基酸Asp52、Tyr57、Lys84、His126,分别定点突变此四个氨基酸,酶活力的丧失均在97.8%以上,证实此四个氨基酸位于活性中心,为催化残基。为进一步深入研究Perakine还原酶的三维结构、活性位点构造及催化机制,论文的第二部分对Perakine还原酶及酶与辅酶/底物复合物进行了结晶条件的摸索及X-ray三维结构的分析。经赖氨酸残基甲基化修饰后,（His）₆-PR采用气相扩散悬滴法进行结晶,优化后的结晶条件为:晶体生长温度为20℃,酶的浓度在4.5-5.0 mg/ml之间,以pH 7.0的0.1 M柠檬酸钠为结晶缓冲液,25%PEG4000为沉淀剂。所得甲基化（His）₆-PR晶体为正交晶系,属于C222₁空间群,晶胞参数为a=58.796（?）,b=93.042（?）,c=142.997（?）,α=β=γ=90°,每个不对称单元中包含一个酶分子。采用分子置换法对甲基化（His）₆-PR的三维结构进行了解析,经修正最终PR三维结构模型的R因子和R_free因子分别为19.0%和24.7%,分辨率为2.30（?）。PR折叠为（α/β）₈桶状（TIM桶状）结构。在浸泡法和共结晶都无法获得PR与辅酶/底物复合物的情况下,我们根据PR的X-ray三维结构、活性残基（Asp52、Tyr57、Lys84、His126）的定点突变结果,再结合其他AKR酶与辅酶/复合物三维结构,推测了PR辅酶与底物的结合位点及其催化机制。

全文目录

目次  5-7
致谢  7-8
摘要  8-10
Abstract  10-12
缩写  12-14
1 研究背景和立题依据  14-19
2 实验材料  19-24
  2.1 生物材料  19
  2.2 培养基  19-20
  2.3 缓冲系统  20
  2.4 化学试剂  20-21
  2.5 生物试剂  21-22
  2.6 仪器  22-24
3 实验方法  24-46
  3.1 化合物的制备及分析方法  24-29
  3.2 分子生物学方法  29-32
  3.3 蛋白质的纯化和分析  32-35
  3.4 (His)_6-PR酶特征的研究  35-37
  3.5 定点突变  37-39
  3.6 蛇根木细胞内桂皮醛类衍生物的检测  39-40
  3.7 序列分析  40
  3.8 PR的结晶  40-43
  3.9 甲基化(His)_6-PR晶体X-ray衍射数据收集、处理  43-45
  3.10 甲基化(His)_6-PR晶体X-ray三维结构的解析  45-46
4 实验结果  46-87
  4.1 PR DNA和氨基酸序列  46
  4.2 PR氨基酸序列分析和比对  46-49
  4.3 (His)_6-PR的异源表达及纯化  49-52
  4.4 21-OH-Raumacline的制备、分离和鉴定  52-54
  4.5 苯甲醇同系物类、硝基苯甲醇类、桂皮醇类衍生物的制备  54-56
  4.6 (His)_6-PR酶的特征研究  56-69
  4.7 定点突变  69-71
  4.8 蛇根木悬浮细胞中桂皮醛类化合物的检测  71-72
  4.9 (His)_6-PR氮端His_6-tag的切除  72
  4.10 PR结晶条件的筛选  72-76
  4.11 甲基化(His)_6-PR晶体的鉴定  76
  4.12 甲基化(His)_6-PR与底物/辅酶共结晶  76-77
  4.13 甲基化(His)_6-PR晶体X-ray衍射数据收集和处理  77-81
  4.14 甲基化(His)_6-PR X-ray三维结构的解析  81-87
5 讨论  87-107
  5.1 PR催化的酶促反应  87
  5.2 PR氨基酸序列的分析及AKR超家族  87-90
  5.3 (His)_6-PR酶的特征  90-92
  5.4 PR的结晶  92-98
  5.5 PR三维结构分析  98-106
  5.6 PR未来研究的展望  106-107
6 结论  107-109
7 蛇根木阿吗灵生物合成途径研究进展  109-137
  7.1 蛇根木和阿吗灵药用研究背景  109-111
  7.2 蛇根木中阿吗灵生物合成途径  111-137
参考文献  137-153
作者简历  153-154

蛇根木Perakine还原酶的表达、酶特征研究、定点突变、结晶及三维结构

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