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Snail基因修饰对骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

作　者: 查运红
导　师: 梅元武
学　校: 华中科技大学
专　业: 神经病学
关键词: Snail 骨髓间充质干细胞基因转染生长曲线转录因子Snail 细胞迁移蛋白激酶B(Akt/PKB) 趋化因子 SDF-1 CXCR4 Transwell 中和抗体 Sub-G1凋亡峰早期凋亡率细胞骨架基质金属蛋白酶2 ERK1/2 PI3K
分类号: R329.2
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

第一部分Snail真核表达质粒扩增及转染骨髓间充质干细胞的实验研究目的:研究Snail基因在人骨髓间充质干细胞(MSCs)中的转染和表达,Snail对骨髓基质细胞生物学性状及生长等方面的影响,探讨骨髓基质细胞作为Snail基因受体细胞的可行性。方法:采用密度梯度离心法、贴壁筛选法并结合传代对成人骨髓MSC进行纯化和体外扩增,观察细胞形态和表面标志物的表达特点,流式细胞仪检测骨髓MSC表面抗原表达,脂质体法将重组真核表达载体(pCAGGSneo-snail-HA)及对照空质粒(pCAGGSneo)转染MSCs,G418筛选稳定表达,绘制转染后细胞的生长曲线,分别于转染后48小时和4周利用免疫荧光染色技术及免疫印迹法检测MSCs报告基因HA及目的基因Snail表达情况。结果:成人骨髓MSC培养3天后有散在呈针尖状的贴壁细胞,7~10天后形成集落或融合呈纤维状,3周左右细胞生长可汇合至80-90%,间充质样细胞呈长梭形,走向趋向一致,传代后1周左右即可融合,3~5代后基本纯化,细胞形态单一,细胞排列具有典型的旋涡状结构。流式细胞仪检测结果显示:CD34表达阴性及CD29表达阳性;500μg/ml的G418是最适筛选浓度,pCAGGSneo-Snail-HA转染后不同时期的MSCs在蛋白水平均可检测到目的基因snail及报告基因HA的表达;生长曲线示重组真核表达载体(pCAGGSneo-snail-HA)及对照空质粒(pCAGGSneo)转染后的细胞(即MSCs-Sna和MSCs-neo)生长曲线与未转染的同代MSCs相比,倍增时间稍稍延长,一代时间约比未转染的细胞多一天,而MSCs-Sna和MSCs-neo之间倍增时间及一代时间没有明显差异。结论:分离培养的细胞为间充质干细胞且成分单一,第3、5代细胞很纯且生长旺盛,适用于做转染或以后的研究,pCAGGSneo-snail-HA可以在MSCs内获得瞬时和长期表达,且Snail表达对MSCs的生长速度无明显影响。MSCs可以作为Snail基因的受体细胞,为下一步研究Snail对MSCs迁移趋化、存活抗凋亡及基质金属蛋白酶2分泌等生物学特性的影响奠定基础。第二部分Snail基因修饰诱导AKT、ERK活化对骨髓间充质干细胞迁移的影响目的:探讨Snail基因修饰对骨髓间充质干细胞迁移力的影响,及磷脂酰肌醇3激酶( phosphatidylinosital3-kinase , PI-3K )、细胞外信号调节激酶1/2 (extracellular signal-regulated kinase, ERK1/2)及P38丝裂原活化的蛋白激酶p38(mitogen-activated protein kinase,P38 MAPK)等信号通路在Snail转染骨髓间充质干细胞迁移能力改变中的调控作用。方法:采用免疫荧光细胞化学、Western Blot方法检测Snail基因修饰后骨髓间充质干细胞内PI3K、ERK1/2和P38/MAPK信号通路的表达变化,用跨膜迁移实验(Transwell实验)来评价MSCs的侵袭迁移能力,比较转染Snail质粒和转染对照空质粒的骨髓间充质干细胞的差异,并比较用和不用各信号通路干预剂的差异。结果:Western blot结果表明, MSCs-Sna细胞P-ERK1/2与总ERK1/2的比值(ERK的磷酸化活性)显著高于MSCs-neo组(0.14±0.04 vs. 0.6±0.09, P<0.05)。同时,MSCs-Sna细胞内p-Akt与总Akt的比值(AKT的磷酸化活性)较MSCs-neo组亦显著性增加(0.20±0.05 vs. 0.75±0.1, P<0.05)。免疫荧光细胞化学染色显示P-ERK1/2、p-Akt在MSCs-neo中均为较弱的绿色荧光,且多分布在细胞胞浆内。而在MSCs-Sna中P-ERK1/2、p-Akt荧光强度明显增强,核内亦存在较多分布。p-P38在MSCs-neo和MSCs-Sna细胞核和胞浆中均呈阴性表达。Transwell体外跨膜侵袭迁移实验显示Snail质粒转染MSCs(MSCs-Sna)较对照空质粒转染MSCs(MSCs-neo)细胞迁移率增加(p<0.05),PI-3K信号通路特异性抑制剂Wortmannin和ERK通路抑制剂PD98059能显著抑制此迁移率的增加(p<0.05)。各浓度P38通路抑制剂SB203580对MSCs-neo和MSCs-Sna的跨膜迁移数量均无明显抑制作用(P>0.05)。结论: Snail基因修饰可增加骨髓间充质干细胞AKT、ERK1/2磷酸化水平,并促进骨髓间充质干细胞的迁移,PI3K通路的特异性抑制剂Wortmannin和ERK通路抑制剂PD98059可分别抑制Snail修饰诱导的AKT、ERK1/2的磷酸化,降低骨髓间充质干细胞迁移能力;SB203580对Snail的促细胞迁移作用无明显影响。PI3K和ERK信号通路在Snail基因促进骨髓间充质干细胞迁移功能的调控中可能发挥了重要作用。第三部分Snail基因修饰对骨髓间充质干细胞CXCR4表达水平及向SDF-1趋化能力影响的研究目的:观察MSCs在Snail基因修饰后细胞膜表面相应特异性受体CXCR4表达水平、及对SDF-1的趋化能力的变化。为探索提高MSCs移植后向受损后局部常高表达SDF-1的器官组织趋化迁移能力的方法提供研究基础。方法:采用免疫荧光细胞化学染色、荧光标记流式细胞仪技术及RT-PCR技术检测Snail基因修饰后的骨髓间充质干细胞上CXCR4受体的表达水平;采用体外Transwell跨膜趋化实验评价MSCs向SDF-1的趋向迁移能力,观察大小不同浓度的抗CXCR4中和抗体对趋化实验的干预作用。结果:流式细胞仪荧光检测显示,MSCs-neo和MSCs-Sna细胞表面均有CXCR4受体的表达,其中MSCs-Sna的阳性表达率明显高于MSCs-neo的阳性表达率(64.25%±7.22% vs. 7.45%±0.91%, P<0.05)。免疫荧光细胞化学检测显示CXCR4在MSCs-neo和MSCs-Sna的细胞膜上均有阳性表达,但在MSCs-neo中为较弱的绿色荧光,而在MSCs-Sna中CXCR4荧光强度明显增强。RT-PCR结果显示,以GAPDH mRNA为内参照,在MSCs-neo、MSCs-Sna细胞中都有CXCR4 mRNA的表达,但在MSCs-Sna细胞中的表达显著高于MSCs-neo(0.916±0.102 vs. 0.410±0.050,P<0.05)。体外跨膜趋化迁移实验显示,MSCs-Sna在SDF-1诱导下的细胞迁移量较MSCs-neo显著增加(p<0.05)。阻断性CXCR4单抗(12G5)(中和抗体)加于微孔隔离室的上室后可显著减少SDF-1α诱导的MSCs-Sna趋化运动,且10ug/ml的CXCR4单抗对SDF-1α诱导的细胞趋化运动的抑制作用较强1ug/ml的CXCR4单抗作用更为明显。同时,IgG阴性对照抗体对SDF-1α诱导的MSCs-Sna趋化运动没有抑制效应。结论:Snail可上调MSCs趋化因子受体CXCR4分子的表达,并可通过这一环节促进骨髓间充质干细胞对相应趋化因子SDF-1的趋化作用,这提示了通过上调Snail的表达而提高MSCs向正调节表达SDF-1的受损组织(例如脑的缺血半暗带等部位)迁移效率的可行性,为提高MSCs的迁移能力及移植效率的研究方向提供了新思路和实验依据,并为以后进一步开展提高MSCs向受损组织器官迁移的在体实验研究提供了实验基础。第四部分Snail基因修饰对骨髓间充质干细胞骨架结构稳定作用及对IL-4和无血清培养诱导细胞凋亡的保护作用研究目的:观察Snail对骨髓MSCs在离体无血清培养下细胞骨架的变化及凋亡的影响,并研究Snail对MSCs在含IL-4培养基中发生凋亡的保护作用,为探索提高MSCs移植后存活能力的方法提供研究基础。方法:MSCs-Sna及MSCs-neo于体外无血清培养基中培养后,β-Actin免疫荧光细胞染色观察细胞骨架,流式细胞仪检测细胞Sub-G1凋亡峰,及Annexin V/PI双标法检测细胞早期凋亡率(Annexin V+/PI- %),并比较snail转染及未转染的MSCs(即MSC-sna及MSC-neo)在以上方面的差异。同样的方法,MSCs-Sna及MSCs-neo在含IL-4(20ng/ml)和不含IL-4的完全培养基中培养24小时后,收集细胞流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:无血清培养24小时后,MSCs-Sna细胞骨架排列保持正常有序分布状态,细胞长极存在较长的应力纤维束,细胞轮廓清晰;而MSCs-neo细胞骨架排列出现紊乱,基本细胞形态尚保持。无血清培养72小时后可见,MSCs-neo不能维持正常形态,轮廓模糊,萎缩成团状,细胞骨架断裂紊乱;与之相比,MSCs-Sna无血清培养72小时后尚能维持基本形态,细胞轮廓尚清晰,细胞骨架依然可见有序排列。无血清培养24小时,MSCs-Sna和MSCs-neo之间比较凋亡率没有显著差异;无血清培养72小时后MSCs-Sna Sub-G1凋亡细胞率和Annexin V+/PI-%早期凋亡率(34.33%±5.51%和12.5%±2.2%)较MSCs-neo凋亡率(52%±8.19%和30%±4.3%)低,且有统计学差异(p<0.05);细胞在含IL-4(20ng/ml)和不含IL-4的完全培养基中培养24小时后,检测annexin-V+PI- %(早期凋亡率),比较MSCs-Sna和MSCs-neo凋亡率的差异:加入IL-4后MSCs-neo的早期凋亡较未加入IL-4时增高达5倍,而对于转染Snail表达载体后的MSCs(即MSCSs-Sna),加入IL-4后MSCs-Sna早期凋亡增高仅达未加入IL-4的2.6倍。结论:经Snail基因修饰,MSCs骨架结构的稳定性及在体外无血清培养或IL-4等促凋亡因素存在的环境中抗凋亡能力增加。第五部分Snail基因修饰对骨髓间充质干细胞MMP2表达的影响及其信号传导通路的研究目的研究Snail基因修饰对骨髓间充质干细胞MMP-2表达的影响,及细胞外信号调节激酶1/2 (extracellular signal-regulated kinase, ERK1/2)和PI-3K/AKT信号通路在Snail转染骨髓间充质干细胞MMP-2表达改变中的调控作用。方法应用脂质体介导的方法将携带Snail基因的重组载体pCAGGSneo-Snail-HA导入体外培养的骨髓间充质干细胞中,用G418筛选获得阳性细胞。采用RT-PCR检测细胞内MMP-2 mRNA的表达,明胶电泳酶谱分析细胞上清液中基质金属蛋白酶2(MMP-2)的活力,并比较转染Snail质粒和转染对照空质粒的MSCs的差异;阻断实验以不同浓度ERK激酶特异性抑制剂(PD98059)或和PI3K通路特异性抑制剂(Wortmannin)干预后Western-blot检测MSCs细胞ERK、AKT磷酸化水平变化,确定PD98059和Wortmannin分别抑制Snail诱导的MSCs细胞ERK激酶和AKT激酶磷酸化的有效浓度,进而研究其对Snail转染MSCsMMP-2 mRNA水平及培养上清中MMP-2活性的影响。结果:(1)Western blot分析显示MSCs-Sna细胞p-Akt和p-ERK水平较MSCs-neo均明显增高;Wortmannin和PD98059可分别以剂量依赖性抑制MSCs-Sna细胞p-Akt和p-ERK水平;可有效抑制Snail诱导的MSCs细胞ERK激酶及AKT激酶磷酸化的PD98059和Wortmannin相应浓度分别为50μmol/L和40 nmol/L。(2)以GAPDH mRNA为内参照,RT-PCR结果显示,MSCs-Sna细胞中MMP-2 mRNA的表达显著高于MSCs-neo(0.680±0.104 vs. 1.803±0.301,P<0.05);PD98059(50μmol/L)、Wortmannin(40 nmol/L)明显抑制了Snail修饰诱导的MMP-2 mRNA水平,抑制率分别为33%和30%;而两者联合给予对MSCs-Sna细胞MMP-2基因表达的抑制作用具有协同作用,抑制率为56%,与MSCs-Sna组相比,差异有统计学意义(0.803±0.160 vs. 1.807±0.304, P<0.05)。(3)明胶酶谱实验显示MSCs-Sna有较高水平MMP-2活性,为对照组(MSCs-neo)的1.79±0.22倍(p<0.05);而在50μmol/L PD98059作用后下降至(1.28±0.12)倍(P<0.05);在40 nmol/L Wortmannin作用后下降至(1.24±0.21)倍(P<0.05);PD98059与Wortmannin联合干预后下降至(0.98±0.23)(P<0.05);而SB203580处理对MSCs-Sna细胞MMP-2活力的影响无显著性差异(P>0.05)。结论Snail能促进MSCs的MMP-2的转录及MMP-2蛋白的表达。MMP-2可能是MSCs的细胞内受转录因子Snail调控作用的耙基因之一,且ERK1/2及PI3K转导通路的激活在此过程中具有调控作用。

全文目录

前言  5-12
中文摘要  12-18
ABSTRACT  18-25
第一部分 SNAIL真核表达质粒的扩增及转染骨髓基质干细胞的实验研究  25-40
  1 材料和方法  25-28
  2 结果  28-30
  3 讨论  30-33
  参考文献  33-35
  附图  35-40
第二部分 SNAIL基因修饰对骨髓间充质干细胞迁移趋化能力的影响及相关分子机制研究  40-54
  1 材料和方法  41-43
  2 结果  43-44
  3 讨论  44-46
  参考文献  46-48
  附图  48-54
第三部分 SNAIL基因修饰对骨髓间充质干细胞CXCR4 表达水平及向SDF-1 趋化能力影响的研究  54-66
  1 材料和方法  55-56
  2 结果  56-57
  3 讨论  57-60
  参考文献  60-62
  附图  62-66
第四部分 SNAIL基因修饰对骨髓间充质干细胞骨架结构稳定作用及对无血清培养诱导细胞凋亡的保护作用研究  66-74
  1 材料和方法  66-67
  2 结果  67-68
  3 讨论  68-70
  参考文献  70-71
  附图  71-74
第五部分 SNAIL基因修饰对骨髓间充质干细胞MMP2 表达的影响及其信号传导通路的研究  74-85
  1 材料和方法  74-76
  2 结果  76-78
  3 讨论  78-80
  参考文献  80-81
  附图  81-85
全文小结  85-87
综述：MSCS的研究概况  87-97
附录一该实验所用方法  97-104
附录二攻读学位期间发表的文章  104-105
致谢  105

Snail基因修饰对骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

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