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微囊藻毒素诱导SD大鼠睾丸支持细胞凋亡效应

作　者: 张丰泉
导　师: 张慧珍
学　校: 郑州大学
专　业: 劳动卫生与环境卫生学
关键词: 微囊藻毒素-LR SD大鼠 睾丸支持细胞 凋亡相关基因
分类号: R114
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


微囊藻毒素(Microcystins, MCs)是由水华蓝藻产生的一类多肽化合物,现已发现80多种MCs, MC-LR是研究较深入的一种。在关于MCs对生殖系统的毒性作用研究中,多涉及生殖器官、精子质量和相关激素,而关于细胞分子水平的机制研究报道尚少。目的本研究利用体外培养的大鼠睾丸支持细胞为模型研究MC-LR对生殖细胞活性的影响及其诱导支持细胞的凋亡,同时检测凋亡相关基因P53、bax和bcl-2mRNA及蛋白水平的表达,从基因及蛋白水平阐述MC-LR对生殖细胞的凋亡的调控作用。方法1.从未成年雄性SD大鼠睾丸分离纯化睾丸支持细胞,建立原代培养细的胞模型。2.用甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)和中性红(neutral red, NR)实验检测MC-LR对支持细胞活性的影响。3. Hoechst荧光染色法检测MC-LR诱导的凋亡睾丸支持细胞。4.反转录聚合酶链式反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)法检测MC-LR染毒后细胞中凋亡相关基因p53、bcl-2、bax mRNA水平的表达情况。5. Western blot法检测不同剂量MC-LR染毒不同时间对支持细胞凋亡相关蛋白P53、Bcl-2、Bax的影响。6. Caspase-3底物切除法检测MC-LR对细胞中caspase-3的活性改变。结果1.低剂量MC-LR (0.02～1μg/ml)染毒睾丸支持细胞24h和48h后,MTT和NR检测结果显示细胞活性升高。高剂量MC-LR(10μg/ml和20μg/ml)染毒24h和48h细胞活性显著降低(P<0.05)。2. Hoechst荧光染色结果：随着MC-LR剂量的增高诱导的凋亡细胞增多。3. RT-PCR结果：支持细胞暴露MC-LR 24h,10μg/ml剂量组中p53 mRNA相对表达量与对照组相比明显升高(P<0.05)。1μg/ml剂量组bcl-2 mRNA相对表达量升高(P0.05),1Oμg/ml组表达量明显降低(P<0.05)。bax mRNA在10μg/ml剂量组细胞中相对表达明显升高且差异有统计学意义(P<0.05)；暴露48h后各目的基因mRNA相对表达量与暴露24h时的趋势相同,但其10μg/ml组与对照组相比表达量的变化更明显且差异均有统计学意义(P0.05)。4. Western blot结果：睾丸支持细胞暴露于MC-LR 24h,与对照相比1μg/ml剂量组P53蛋白相对表达量升高且差异有统计学意义(P0.05),Bax和Bcl-2蛋白相对表达量改变不明显。10μg/ml剂量组P53和Bax蛋白相对表达量显著升高(P<0.05),Bcl-2相对表达量显著降低(P0.05)。MC-LR作用支持细胞48h后,1μg/ml剂量组P53蛋白表达量升高但差异无统计学意义,Bax表达量显著降低(P<0.05),Bcl-2表达量则显著升高(P<0.05)。10μg/ml剂量组P53和Bax相对表达量显著升高(P<0.05),Bcl-2表达量显著降低(P<0.05)。5. Caspase-3检测结果：支持细胞染毒MC-LR 24h和48h,与对照组相比1μg/ml剂量组细胞中caspase-3活性变化不明显；10μg/ml剂量组细胞中caspase-3活性明显升高(P<0.05)。结论1.低剂量MC-LR对睾丸支持细胞具有刺激效应,使细胞活性增强；高剂量MC-LR对睾丸支持细胞有抑制效应,使细胞活性降低。2. MC-LR能诱导睾丸支持细胞发生凋亡。3.凋亡相关基因p53,bcl-2,bax, caspase-3在MC-LR诱导睾丸支持细胞的凋亡中起调控作用。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-11
1 前言  11-14
2 材料与方法  14-27
  2.1 MC-LR对体外培养大鼠睾丸支持细胞活性的影响的测定  14-16
  2.2 大鼠睾丸支持细胞凋亡检测  16-17
  2.3 MC-LR对体外培养大鼠睾丸支持细胞凋亡相关基因表达的测定  17-20
  2.4 MC-LR对体外培养大鼠睾丸支持细胞凋亡相关蛋白表达的测定  20-25
  2.5 细胞中caspase-3活性检测  25-26
  2.6 质量控制  26
  2.7 统计分析方法  26-27
3 实验结果  27-35
  3.1 MC-LR对睾丸支持细胞活性的影响  27-29
  3.2 Hoechst 33258荧光染色结果  29
  3.3 MC-LR对睾丸支持细胞中凋亡相关基因mRNA水平表达的影响  29-32
  3.4 MC-LR对睾丸支持细胞中凋亡相关蛋白表达的影响  32-34
  3.5 caspase-3活性实验结果  34-35
4 讨论  35-38
  4.1 细胞模型的建立  35
  4.2 MC-LR对睾丸支持细胞活性的影响  35-36
  4.3 MC-LR诱导睾丸支持细胞凋亡  36
  4.4 MC-LR对睾丸支持细胞中p53,bcl-2,bax和caspase-3表达的影响  36-38
5 结论  38-39
参考文献  39-42
综述  42-56
  参考文献  53-56
致谢  56-57
个人简历  57

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中图分类: > 医药、卫生 > 预防医学、卫生学 > 卫生基础科学 > 卫生毒理
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