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聚乙烯亚胺—胆固醇结合脂质微泡介导基因转染系统研究及应用

作　者: 江永南
导　师: 陈建海
学　校: 南方医科大学
专　业: 生物医学工程
关键词: 聚乙亚胺-胆固醇脂质微泡基因转染
分类号: R346
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

基因治疗是通过插入治疗基因至病变细胞内而产生特定功能的蛋白质或抑制异常基因表达,从而治疗疾病的一种新方法。研究开发安全、高效、靶向的基因转染系统是基因治疗成功的关键,目前基因载体分为两类：病毒载体和非病毒载体。非病毒载体因具有低免疫原性、能携带大分子量DNA及生物安全性高等优点而倍受青睐。其中一种阳离子聚合物聚乙烯亚胺(PEI,Polyethyenimine)受到广泛关注。PEI有线型或分枝状结构,有较高的阳性电荷,与带有阴性电荷的DNA或RNA结合能力较强,所形成的复合物可粘附到细胞表面被细胞内吞。PEI有很多质子化的多级氨的氮原子,当溶酶体内的pH下降时,PEI能够大量捕获质子,并引起Cl-内流,导致溶酶体渗透性肿胀,最后溶酶体破裂从而将内吞的DNA释放到细胞质(即质子海绵效应),DNA释放后进入细胞核中并表达。PEI的分子量的范围变化很大,一般应用于基因转染载体的PEI的分子量在5000-25000Da。高分子量的PEI基因转染效率很高,如分枝状PEI25KDa,但毒性也很大。低分子量PEI毒性很低,但一般而言其基因转染效率很低,并且PEI作为基因转染载体直接体内应用会导致红细胞的聚集,可以与血液中的白蛋白等非特异性结合,导致聚合体的形成,体内应用基因转染效率低。所以需要对PEI进行改性。改性PEI的目的主要是降低PEI的毒性,提高PEI和DNA复合物的稳定性,提高靶向性,减少与白蛋白的非特异性结合,延长体内的时间。研究目的：为了探讨不同分子量PEI接枝后性能和毒性的变化规律,本研究选择低分子量和高分子量的PEI进行胆固醇接枝,合成一系列的不同氨基接枝率的聚合物,研究其细胞毒性、DNA压缩性、缓冲性、抗核酸酶降解性,从而筛选合适的聚乙烯亚胺-胆固醇脂质聚合物；同时构建具有抗蛋白沉淀作用的中性脂质(聚乙二醇修饰)微泡,采用静态自组装技术把PEI-Chol/DNA复合物与脂质微泡融合,形成脂质微泡/PEI-Chol/DNA复合物,采用超声定位达到靶向目的。最终构建高效低毒的聚乙烯亚胺-胆固醇(Polyethyleneimine cholesterol,PEI-Chol)结合脂质微泡介导的基因转染系统,为临床提供安全高效的给药系统。研究方法和内容：分四大部分第一部分聚乙烯亚胺-胆固醇聚合物的合成、表征与性能测试用胆固醇甲酰氯连接聚乙烯亚胺的氨基形成PEI-Chol脂质聚合物,分别用IR、1H-NMR、DSC对聚合物进行表征；采用酸碱滴定法结合公式β=dC(HCl)/dpH计算聚合物的缓冲容量；采用荧光探针法测定聚合物的临界胶束浓度(CMC)；并运用MTT比色法测定不同分子量、不同接枝率聚合物的细胞毒性。第二部分PEI-Chol/DNA复合物的制备及生物物理性能表征采用碱裂解法,通过制备大肠杆菌感受态细胞、pEGFP-Cl转入和重组增殖、碱裂解法纯化质粒等工序,提取质粒DNA；经琼脂糖凝胶鉴定大小及纯度。采用激光粒度仪测定PEI及PEI-Chol与pEGFP-Cl所形成的复合物的粒径、Zeta电位；琼脂糖凝胶电泳法考察PEI-Chol与DNA的结合能力,及其对DNA在核酸酶I作用下的保护作用,扫描电镜观察复合物的形态。第三部分脂质微泡/PEI-Chol/DNA自组装系统的构建和性能测试采用反相挥发法,结合星点设计-球面效应法优化脂质微泡制备的条件。以微泡浓度为指标,探讨PEI-Chol聚合物种类、融合温度和融合时间对微泡浓度的影响,激光粒度仪测定微泡复合物的粒径和Zeta电位。并分别从超声对裸DNA完整性、超声对微泡完整性,超声对细胞生存率的影响等方面考察脂质微泡/PEI-Chol/DNA自组装系统的安全性。第四部分脂质微泡/PEI-Chol/DNA转染系统的体外和体内转染试验研究了不同分子量PEI、PEI-Chol聚合物及其微泡介导的基因载体系统的基因转染能力,通过以PEI-Chol(25-5)为对象,考察脂质微泡融合温度、融合时间、N/P比和超声时间对DNA转染效果的影响,确立转染条件,运用流式细胞仪测定脂质微泡/PEI-Chol/DNA转染系统在A549和MCF-7细胞中的转染效果。此外,通过脂多糖(LPS)诱导和制备急性肺损伤(ALI)小鼠动物模型,探讨脂质微泡/PEI-Chol/DNA转染MIF siRNA对急性肺损伤小鼠的保护作用。结果：1.合成的PEI-Chol经IR检测,图谱上显示PEI-Chol的羰基特征峰(1700cm-1),表明聚乙烯亚胺与胆固醇成功连接,根据1H-NMR谱图计算PEI的胺基接枝率,组成及分子量,达到试验预期效果,表明反应可控。DSC图谱显示PEI连接胆固醇后刚性增强。2.同一分子量合成的PEI-Chol,其临界胶束浓度(CMC)随着胆固醇接枝量的增多,临界胶束浓度逐渐下降。3.不同分子量的PEI,缓冲容量随着分子量的增加而增大,同一分子量PEI合成的PEI-Chol,其缓冲容量随着分子量的增加而减少。4.聚合物对Hela、A549、MCF-7相对生长率影响的研究结果发现：低分子量PEI未表现出明显毒性,随着分子量的增大,细胞毒性增强。接枝胆固醇可明显降低PEI的细胞毒性,且接枝胆固醇的量越多,PEI的细胞毒性降低越显著。5.采用碱裂解法制备及纯化后的pEGFP-Cl纯度和大小合适,质粒的A260/A280=1.89±0.025；分子量为4.7kb,浓度为279.37±0.971μg/ml.6.低分子量PEI/DNA复合物的粒径较大,接枝了胆固醇后压缩DNA能力提高,抗酶能力增强；Zeta电位随PEI分子量的增大而增大,接枝胆固醇可使Zeta电位下降；N/P越高,复合物的粒径越小,Zeta电位增高。PEI-Chol与DNA能形成纳米复合物。7.采用星点设计-球面效应法制备的微泡较稳定,能稳定半个月,粒径分布均匀,Zeta电位-8.3mV,最佳制备条件为DPPC(X1)=40mg,PEI-Chol(X2)=7.5mg,DSPE-PEG2000(X3)=4.5mg。微泡浓度为8.22×109个/ml。8.采用PEI-Chol (1.8-1)和PEI-Chol(25-5)融合制成的微泡复合物的微泡浓度高于PEI-Chol(10-1)和PEI-Chol(25-1)融合制成的微泡浓度,另外PEI-Chol制备的微泡复合物的Zeta电位明显低于PEI-Chol/DNA复合物。9.超声频率2MHz、120s条件下,MI在1.0范围内,对A549细胞、MCF-7细胞的生存率以及DNA没有有显著影响,表明系统安全。10.转染条件：融合温度55℃,时间60min,超声发射参数：连续波,频率2MHz,深度60mm,机械指数(mechanical index,MI) 1.0,时间60s。细胞转染实验发现：接枝胆固醇明显提升PEI1.8K的细胞转染效果,如结合脂质微泡,转染率和抗血清能力均有提高。11.成功构建以LPS刺激引起的小鼠肺损伤动物模型,通过正常组、LPS刺激组,PC+LPS+MIF siRNA治疗组(PEI-Chol转染组)以及WP+LPS+MIF siRNA(微泡转染组)等四组之间的对比研究,发现模型组肺组织病理变化明显,而PC+LPS+MIF siRNA治疗组无明显的治疗作用,而WP+LPS+MIF siRNA治疗组能有效改善组织病理变化,并且能有效降低炎症介质TNF-α、IL-1β、IL-6分泌水平,阐明本基因转染系统是有效。结论：1.合成的PEI-Chol聚合物具有以下物理学特点：合适的胆固醇接枝率对缓冲容量影响少,胆固醇基团的引入可改变PEI的亲水性和亲油性,有助于胶束的形成。从而为选择合适的接枝率的PEI-Chol提供依据。2.合成的PEI-Chol聚合物具有以下生理学特点：接枝胆固醇可有效降低PEI的细胞毒性,并且能有效提高低分子量PEI对DNA的压缩性能,提高其抗核酸酶作用,对DNA具有保护作用。3.以PEI-Chol/DNA与中性脂质微泡构建的基因给药系统,质量稳定；其应用的转染条件对细胞生存率、对DNA完整性,没有显著影响。4.聚乙烯亚胺-胆固醇结合脂质微泡介导基因转染系统毒性小,具有抗蛋白沉淀作用,和超声定位释放等作用。体外(A549和MCF-7细胞)能有效转染pEGFP-Cl,体内(小鼠)能有效转染MIF siRNA,对急性肺损伤小鼠的有保护作用。

全文目录

摘要  3-8
ABSTRACT  8-16
前言  16-27
第一部分聚乙烯亚胺-胆固醇聚合物的合成、表征与性能测试  27-67
  第一章聚乙烯亚胺-胆固醇聚合物的合成与表征  27-42
    1.1 试剂和仪器  28-29
    1.2 实验方法  29-32
    1.3 表征  32-34
    1.4 结果与讨论  34-41
    1.5 本章小结  41-42
  第二章聚合物的临界胶束浓度与缓冲容量的测定  42-54
    2.1 试剂和仪器  42-43
    2.2 实验方法  43-44
    2.3 结果与讨论  44-53
    2.4 本章小结  53-54
  第三章聚合物的细胞毒性试验  54-67
    3.1 试剂和仪器  55-56
    3.2 实验方法  56-57
    3.3 结果与讨论  57-66
    3.4 本章小结  66-67
第二部分 PEI-Chol/DNA复合物的制备及生物物理性能表征  67-95
  第四章 pEGFP-C1报告基因制备及鉴定  67-74
    4.1 材料和仪器  67-68
    4.2 实验方法  68-71
    4.3 结果与讨论  71-73
    4.4 本章小结  73-74
  第五章 PEI-Chol/DNA复合物的制备及生物物理性能表征  74-95
    5.1 试剂和仪器  75-76
    5.2 实验方法  76-77
    5.3 结果  77-93
    5.4 讨论  93-94
    5.5 本章小结  94-95
第三部分脂质微泡/PEI-Chol/DNA自组装系统的构建和性能测试  95-132
  第六章脂质微泡的制备与稳定性研究  95-112
    6.1 试剂和仪器  96
    6.2 实验方法  96-99
    6.3 结果与讨论  99-111
    6.4 本章小结  111-112
  第七章脂质微泡/PEI-Chol/DNA自组装系统的构建  112-125
    7.1 试剂和仪器  113
    7.2 实验方法  113-114
    7.3 结果  114-121
    7.4 讨论  121-124
    7.5 本章小结  124-125
  第八章脂质微泡/PEI-Chol/DNA自组装系统安全性初探  125-132
    8.1 材料和仪器  125-126
    8.2 实验方法  126-128
    8.3 结果与讨论  128-131
    8.4 本章小结  131-132
第四部分脂质微泡/PEI-Chol/DNA转染系统的体外和体内转染试验  132-159
  第九章微泡/PEI-Chol/DNA复合物的细胞转染试验  132-150
    9.1 材料和仪器  134
    9.2 实验方法  134-139
    9.3 结果  139-148
    9.4 讨论  148-149
    9.5 本章小结  149-150
  第十章脂质微泡/PEI-Chol/DNA转染MIF siRNA对急性肺损伤小鼠的保护作用初探  150-159
    10.1 材料和仪器  150-151
    10.2 实验方法  151-155
    10.3 结果  155-157
    10.4 讨论  157-158
    10.5 本章小结  158-159
全文总结与创新点  159-164
参考文献  164-176
攻读博士学位期间发表的论文  176-177
致谢  177-179
统计学证明  179

聚乙烯亚胺—胆固醇结合脂质微泡介导基因转染系统研究及应用

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