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一年生膜荚黄芪有效成分与拮抗环磷酰胺毒副作用研究

作　者: 张颖丽
导　师: 张善玉
学　校: 延边大学
专　业: 药物分析学
关键词: 膜荚黄芪皂苷黄酮多糖生物活性
分类号: R285
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的：通过①比较不同生长年限栽植膜荚黄中黄酮类、皂苷类成分的高效液相色谱和薄层色谱信息,以及毛蕊异黄酮、芒柄花素、总黄酮和多糖的含量；②分离纯化一年生栽植膜荚黄芪中黄芪多糖,探讨其对小鼠巨噬细胞RAW264.7释放NO的影响；③观察一年生膜荚黄芪超微粉对环磷酰胺所致小鼠免疫抑制和肾脏毒副作用的影响,为一年生栽植膜荚黄芪的开发与利用提供依据。方法：①采用HPLC-ELSD方法比较一、二和三年生膜荚黄芪中皂苷类成分,色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18 (250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为乙腈—水,二元梯度洗脱15%-50%；流速O.8mL-min-1;洗脱时间90 min,柱温30℃,检测器参数：漂移管温度为105℃,载气压力为2.70 bar; TLC方法比较一、二和三年生膜荚黄芪中皂苷类成分,以氯仿—甲醇—水(13：6：2)为展开剂,10%硫酸乙醇溶液为显色剂；采用HPLC-DAD方法比较一、二和三年生膜荚黄芪中黄酮类成分及毛蕊异黄酮和芒柄花素的含量,色谱柱为BDS Hypersil C18柱(250 mm×4.6mm,5μm, Thermo);二极管阵列检测器(DAD),流动相为乙腈—水,梯度洗脱50 min,流速为1.0mL-min-1,检测波长为254 nm；采用TLC方法比较膜荚黄芪中黄酮类成分,以甲苯—乙酸乙酯—甲酸(8：5：1)溶液为展开剂,二氨基苯甲醛的10%硫酸乙醇溶液为显色剂；苯酚-硫酸法测定不同年生膜荚黄芪中多糖的含量,并进行比较；水提、醇沉、膜透析和葡聚糖凝胶柱法分离纯化多糖,并采用凝胶色谱法测定相对分子质量。②采用膜荚黄芪多糖(ASP40%Ⅰ、ASP60%Ⅰ、ASP60%Ⅱ)刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7,用Griess法测定NO的含量。③取昆明种小鼠随机分为正常对照组、模型组及一年生膜荚黄芪超微粉2g·kg-1和4 g·kg-1组,连续灌胃11 d,第5和10日除正常组腹腔注射等量的生理盐水外,其它各组均腹腔注射环磷酰胺80mg-kg-1,测定小鼠免疫器官胸腺指数、脾脏指数、外周白细胞和血尿素氮含量；另取一批昆明种小鼠随机分为正常对照组、模型组及一年生膜荚黄芪超微粉2 g·kg-1和4 g·kg-1组,连续灌胃10 d,第3、6和9日除正常对照组外各组均腹腔注射给予80mg-kg-1,第10日测定肾组织丙二醛的含量。结果：①不同年生的膜荚黄芪药材皂苷类成分图谱在概貌上基本一致,均出现12个特征峰,各共有峰相对保留时间的RSD在0.112～0.394%(均小于3%),而共有峰相对峰面积的RSD在27.23～143.23%(均大于3%)；薄层色谱图谱的概貌基本一致,Rf相同的位置均出现对应的斑点,但是斑点大小及颜色深浅有所差异；黄酮类成分指纹图谱有7个共有峰,其图谱在概貌上基本一致,各共有峰相对保留时间的RSD在0.008～0.097%之间(均小于3%),而共有峰相对峰面积的RSD在9.61-72.95%之间(均大于3%)；薄层色谱图谱的概貌基本一致,Rf相同的位置均出现相同的斑点,但是斑点大小和颜色深浅有所差异；一、二和三年生膜荚黄芪中主要成分含量分别为毛蕊异黄酮：0.337、0.121和0.119 mg.g-1；芒柄花素：0.101、0.031和0.032 mg.g-1；总黄酮：1.02、1.23和1.79 mg.g-1；总多糖：42.31、23.96和32.52 mg.g-1；分离得到5个部位黄芪多糖,其中ASP 40%Ⅰ、ASP60%Ⅰ和ASP60%Ⅱ3个部位为较纯的多糖,其重均分子质量分别为3.0×105、1.5×105和0.45×105。②实验结果表明,一年生膜荚黄芪多糖ASP40%Ⅰ、ASP60%Ⅰ和ASP60%Ⅱ分别在6.25-200、3.125-200和3.125～200μg·mL-1范围内刺激RAW 264.7细胞分泌NO; 3.125～25范围内,作用的大小依次为ASP40%Ⅰ、ASP60%Ⅰ和ASP60%Ⅱ。③与正常对照组比较,模型组小鼠的胸腺、脾脏指数及外周血白细胞计数均明显降低,肾组织丙二醛含量明显升高；与模型组比较,2 g·kg-1和4 g·kg-1一年生膜荚黄芪超微粉组胸腺指数及外周血白细胞计数均明显升高,肾组织丙二醛含量明显降低,4 g·kg-1一年生黄芪超微粉组血尿素氮含量明显降低。结论：①一年生膜荚黄芪中皂苷类成分的种类与二、三年生基本保持一致,但不同种类皂苷类成分质量差异较大；膜荚黄芪中黄酮类成分含量随着年限的增长而增加,黄酮类成分的种类基本保持一致；一年生膜荚黄芪中皂苷和黄酮的薄层色谱与二、三年生在颜色和形态基本一致,但斑点的大小有所差异；一年生膜荚黄芪中多糖的含量高于二年和三年生黄芪。②黄芪多糖ASP40%Ⅰ、ASP60%Ⅰ和ASP60%Ⅱ均能刺激RAW264.7细胞分泌NO,分子质量越小作用越强；在小剂量时黄芪多糖的作用与浓度之间具有正相关。③一年生膜荚黄芪超微粉组可提高环磷酰胺所致免疫抑制小鼠免疫功能,减轻环磷酰胺对肾脏的毒副作用。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-11
第一章引言  11-13
第二章仪器、材料与试剂  13-14
  2.1 仪器  13
  2.2 实验材料  13
  2.3 实验动物  13-14
第三章一年生栽植膜荚黄芪主要有效成分分析  14-31
  3.1 皂苷类  14-18
  3.2 黄酮类  18-26
  3.3 多糖类  26-29
  3.4 讨论  29-31
第四章一年生膜荚黄芪生物活性实验研究  31-35
  4.1 黄芪多糖对小鼠RAW264.7细胞分泌NO的影响实验研究  31
  4.2 一年生黄芪超微粉拮抗环磷酰胺所致免疫抑制和肾毒效应的实验研究  31-33
  4.3 讨论  33-35
第五章结语  35-36
参考文献  36-39
致谢  39-40
附录A (攻读学位期间发表论文目录)  40-41
综述  41-50
  参考文献  48-50

一年生膜荚黄芪有效成分与拮抗环磷酰胺毒副作用研究

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