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狂犬病Flury病毒致弱分子机制及新型疫苗的研究

作　者: 陶丽红
导　师: 步志高
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 狂犬病病毒 Flury LEP HEP 致弱机制狂犬病疫苗
分类号: S855.3
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

狂犬病(rabies)是一种在全世界范围内流行的,由狂犬病病毒(rabies virus, RV)引起的以中枢神经系统感染(CNS)为特征的人畜共患病。全世界每年死于狂犬病的人数高达55,000,主要发生在发展中国家。目前,狂犬病无法治疗,一旦发病致死率几乎为100%。疫苗免疫是控制狂犬病唯一有效的方法。为研制更加安全、有效的狂犬病疫苗,迫切需要加强对RV病原致病分子机制与免疫机制的基础研究。I. RV Flury传代致弱的分子机制的研究1940年,Koprowski等人从病死女孩脑内分离到狂犬病毒Flury株,经1日龄雏鸡脑内、鸡胚卵黄囊传后,再经鸡胚传代178代以上,无论神经内、外接种都对动物丧失致病力,但新生乳鼠和猴在脑内接种时仍有感染性。在鸡胚传代68代以前的称为“LEP”(鸡胚低代株);高于136代的称为“HEP”(鸡胚高代株)。LEP脑内感染成年小鼠致死,而HEP脑内感染成年小鼠不致死。造成LEP和HEP致病力生物学表型差异的分子机制仍未充分阐明。本研究拟就RV Flury传代致弱的分子机制进行系统研究。对LEP和HEP完整基因组的系统解析表明,LEP和HEP的基因组均含有11,925个核苷酸,相似性达99.3%。LEP和HEP的L基因ORF核苷酸相似性最高为99.7%,N基因(99.6%)、P基因(99.4%)、M基因(99.3%)和G基因(98.9%)依次降低。两株病毒由N、P、M、G和L基因ORF预测的氨基酸序列相似性分别为99.8%、98.3%、99.0%、97.8%和99.6%。比较这两个毒株的5个蛋白的氨基酸序列,共有27个氨基酸发生改变,变化最大的是G蛋白,最保守的是N蛋白。N/P、P/M和M/G间的基因间隔序列完全一致,G/L间的间隔序列仅有一个碱基发生突变。另外,3’、5’端的非编码区及所有基因的转录起始信号和终止信号序列也都一致。在此基础上,建立了Flury LEP和HEP的反向遗传操作系统。从cDNA克隆拯救获得的rLEP在小鼠神经母细胞(NA)和BHK-21细胞上的多步生长动力学曲线与野生型毒株相似,最高生长滴度分别可达3.0×10~8 FFU/ml和5.0×10~7 FFU/ml,体外嗜神经指数为0.78。rLEP通过脑内(i.c.)、滴鼻(i.n.)及肌肉注射(i.m.)不同途径分别感染成年小鼠均致死,LD50分别1 FFU,474 FFU和3.4×10~5 FFU,与野生型毒株相近。从cDNA克隆拯救获得的rHEP在NA和BHK-21细胞上的多步生长动力学曲线与野生型毒株相似,最高生长滴度均可达2.0×10~7FFU/ml,不具备体外嗜神经性,通过i.c.、i.n.及i.m.不同途径分别感染成年小鼠均不致死,表现出与野生型HEP相似的生物学特性和致病力。将HEP的G333位的Gln突变为Arg,形成的突变株rHEPG333R体外嗜神经指数由0变为0.8,与LEP相近,表明rHEPG333R已经回复了嗜神经特性。通过i.c.,i.n.和i.m.3种不同途径分别感染小鼠,rHEPG333R均可使小鼠致死,LD50分别为0.3 FFU、887 FFU和1.4×10~6 FFU。结果表明,G333位点的Arg单个氨基酸突变足以使HEP重新获得对成年小鼠的高致病力。但是,将LEP的G333位点由Arg突变为Gln后,形成的rLEPG333Q突变株尽管体外嗜神经指数下降为0,肌肉接种小鼠全部存活并且无神经症状出现,但通过i.c.或i.n.途径感染小鼠时,rLEPG333Q对小鼠仍显示出高度致死性,LD50分别为36 FFU和2.1×10~5 FFU。结果提示,G333 Arg的替换突变消除了LEP的嗜神经性和外周神经侵入能力,但i.c.或i.n.感染成年小鼠仍保持其高致死力。进一步对rLEPG333Q接种致死小鼠脑内病毒基因组序列进行分析,结果发现,rLEPG333Q在小鼠脑内和NA细胞中复制时,G333位点的Gln人工突变不能保持稳定,发生了嗜神经性的回复突变,因而重新获得对小鼠的致死能力。相反,rHEP无论经i.c或i.n.接种,还是NA细胞连续传代,G333位点的Gln均未发生回复突变。为了澄清影响G333Q突变在神经组织或细胞复制过程中遗传稳定性的因素,进一步构建了嵌合病毒rHEP-G(L)333Q和rLEP-G(H),前者通过将HEP的G基因替换为LEP的G基因,同时G333位点Arg突变为Gln构建而成的,后者通过将LEP的G基因替换为HEP的G基因构建而成的。rHEP-G(L)333Q体外嗜神经指数也和rHEP一样,仍然为0;经i.c.感染小鼠不致死,病毒在小鼠脑内和NA细胞上复制时G333位点的Gln稳定不变。而嵌合病毒rLEP-G(H),在NA细胞上的生长性能显著地低于rLEP,而与rHEP十分接近;体外嗜神经指数也下降为0。尽管如此,小鼠经i.c.接种105 FFU的rLEP-G(H)后,在感染后12天内全部死亡。提取濒死小鼠脑组织RNA和NA细胞传代的第5代培养物进行RT-PCR和测序分析发现,rLEP-G(H)的G333位点Gln(CAG)已经突变为Arg(CGG)。结果表明,造成rHEP和突变株rLEPG333Q在神经组织或细胞中复制时G333位点Gln的遗传稳定性存在差异是LEP基因组骨架上的某个(或某些)因素而不是G蛋白本身引起的。负链RNA病毒的RNA聚合酶的低保真性是病毒突变最主要的原因。为此,将rLEPG333Q的L基因替换为HEP的L基因,构建了嵌合病毒rLEPG333Q-L(H)。成年小鼠脑内接种105 FFU的rLEPG333Q-L(H)全部存活且没有出现神经症状,rLEPG333Q-L(H)的G333位点Gln(CAA)在鼠脑和NA细胞传代时稳定不变。结果表明,L蛋白与G333位点的Gln突变的遗传稳定性密切相关。L基因与G基因的协同变异、进化导致Flury在鸡胚传代过程获得致弱。同时,我们还研究了GR333Q突变对Flury诱导细胞凋亡能力的影响。结果发现,rLEP和rHEPG333R感染的NA细胞中,NA细胞发生凋亡的比例分别为2.9±0.7%和2.8±0.6%,与空白对照组的细胞凋亡水平相似(2.6±0.6 %)。相比之下,rHEP、rLEPG333Q、rHEP-G(L)333Q和LEPG333Q-L(H)诱导的凋亡水平则高于对照组,分别为对照组的2.1、2.4、2.1和2.1倍。进一步利用western blot分析比较在病毒感染的细胞中不同蛋白的表达水平。结果发现,rLEP与rLEPG333Q、rHEP-G(L)333Q或rLEPG333Q-L(H)相比,G蛋白表达水平无明显差异;rHEP与rHEPG333R的G蛋白表达量也十分相近。结果显示,Flury病毒诱导NA细胞凋亡能力与G蛋白的表达量并无一定相关性。这一结果与前人报道G蛋白的表达量与凋亡诱导水平呈正相关的结果有所不同,提示狂犬病病毒诱导神经细胞凋亡的分子机制仍然有待进一步研究。嵌合病毒rHEP-G(L)333Q和rLEPG333Q-L(H)高度致弱,失去嗜神经特性,并且遗传稳定。对小鼠的免疫和攻毒试验结果显示:rHEP-G(L)333Q和rLEPG333Q-L(H)免疫小鼠无论诱导的RV中和抗体水平,还是对街毒攻击的保护效力,均显著高于LEP和HEP,具有开发成为分子修饰弱毒疫苗的潜力。II.狂犬病灭活疫苗的研制RV灭活疫苗在生物安全性上具有突出优势,但是制造成本高,价格相对昂贵,免疫期相对较短,在发展中国家特别是农村地区难以推广应用。提高灭活疫苗抗原的单位生产效率,将有助于降低生产成本,同时提高免疫效力,延长疫苗接种间隔期。本研究构建了表达双重G蛋白基因的重组RV Flury LEP病毒株rLEP-G。生物学特性分析显示,rLEP-G在NA和BHK-21细胞的生长滴度分别可达7.0×10~8 FFU/ml和1.0×10~8 FFU/ml,体外嗜神经指数为0.85,与LEP相近。rLEP-G通过i.c.接种感染小鼠的LD50为1 FFU,与LEP的致病性无显著差异。Western blot结果显示,rLEP-G感染BHK-21细胞后G蛋白的表达量显著提高3倍。分别以rLEP-G和LEP为种毒,按相同细胞培养量制备成灭活疫苗,对进行小鼠和比格犬的免疫效力试验。结果表明,无论小鼠还是比格犬,rLEP-G灭活疫苗诱导RV中和抗体的能力均显著高于LEP灭活疫苗,表现出良好的免疫原性,适用于狂犬病灭活疫苗的开发。

全文目录

摘要  6-9
Abstract  9-16
第一章绪论  16-29
  1.1 狂犬病病毒的生活周期  17-21
    1.1.1 狂犬病病毒的受体  17-18
    1.1.2 细胞内摄作用  18
    1.1.3 胞内病毒运输  18
    1.1.4 复制、转录和蛋白表达  18-20
    1.1.5 包装和出芽  20-21
  1.2 狂犬病病毒的致病决定因子  21-25
    1.2.1 糖蛋白 G 和致病性  21-22
    1.2.2 细胞凋亡和致病性  22-23
    1.2.3 逆向轴突运输  23-24
    1.2.4 逃避宿主的先天性免疫应答  24-25
  1.3 利用基因操作技术开发新型狂犬病疫苗  25-27
    1.3.1 狂犬病疫苗现状  25
    1.3.2 新型狂犬病疫苗  25-27
  1.4 本研究的目的和意义  27-29
第二章狂犬病病毒Flury LEP和Flury HEP反向遗传操作系统的建立  29-42
  2.1 材料  29-31
    2.1.1 病毒株  29
    2.1.2 小鼠和细胞  29
    2.1.3 质粒  29
    2.1.4 主要试剂和仪器  29-30
    2.1.5 引物设计与合成  30-31
  2.2 方法  31-33
    2.2.1 病毒基因组的提取、反转录和PCR  31
    2.2.2 RT-PCR 产物的克隆  31
    2.2.3 基因组全长cDNA 克隆的构建  31-32
    2.2.4 辅助质粒的构建  32
    2.2.5 病毒拯救  32
    2.2.6 救获病毒的序列鉴定  32-33
    2.2.7 种毒的制备及滴定  33
    2.2.8 病毒生长动力学曲线的测定  33
    2.2.9 病毒毒力测定  33
  2.3 结果  33-40
    2.3.1 Flury LEP 和 HEP 的基因组序列比较  33-36
    2.3.2 Flury LEP 和 HEP 的基因组全长cDNA 克隆和辅助质粒的构建  36
    2.3.3 病毒的拯救  36-37
    2.3.4 病毒体外生长特性  37-38
    2.3.5 对小鼠的致病性  38-40
    2.3.6 核酸序列号  40
  2.4 讨论  40-42
第三章狂犬病病毒Flury LEP分子致病机理和致弱机制的研究  42-58
  3.1 材料与方法  42-46
    3.1.1 病毒株及狂犬病标准血清  42
    3.1.2 主要试剂和仪器  42
    3.1.3 引物设计与合成  42-43
    3.1.4 突变病毒、嵌合病毒全长基因组cDNA克隆的构建  43
    3.1.5 病毒的拯救  43-44
    3.1.6 救获病毒的序列鉴定  44
    3.1.7 种毒的制备及滴定  44
    3.1.8 病毒生长动力学曲线的测定  44
    3.1.9 病毒毒力测定  44-45
    3.1.10 体外传代  45
    3.1.11 细胞凋亡检测  45
    3.1.12 Western blot  45
    3.1.13 BALB/c小鼠的免疫及攻毒保护试验  45
    3.1.14 中和抗体滴定试验  45-46
  3.2 结果  46-55
    3.2.1 G333 Arg 的替换消除了 LEP 的神经侵入能力但对成年小鼠仍能致死  46
    3.2.2 rLEPG333Q 在神经组织或细胞复制时的回复突变使其重新获得对小鼠的致病力  46-50
    3.2.3 LEP 基因组背景影响了 G333 位点 Gln 的稳定性  50-51
    3.2.4 L 蛋白与 G333 位点的 Gln 的稳定性密切相关  51
    3.2.5 G_(R333Q)突变对Flury诱导细胞凋亡能力的影响  51
    3.2.6 致弱毒株可诱导更强的免疫反应和保护率  51-55
  3.3 讨论  55-58
第四章双表达糖蛋白基因的重组狂犬病病毒的构建及其生物学特性鉴定  58-67
  4.1 材料与方法  58-61
    4.1.1 材料  58
    4.1.2 引物设计与合成  58
    4.1.3 含有双 G 基因的基因组全长cDNA 的构建  58-59
    4.1.4 病毒的拯救  59
    4.1.5 救获病毒的序列鉴定  59-60
    4.1.6 种毒的制备及滴定  60
    4.1.7 病毒生长动力学曲线的测定  60
    4.1.8 病毒毒力测定  60
    4.1.9 体外传代  60
    4.1.10 Western blot 检测重组病毒 G 蛋白表达  60
    4.1.11 灭活疫苗的制备  60
    4.1.12 灭活疫苗免疫比格犬和BALB/c 小鼠  60-61
  4.2 结果  61-65
    4.2.1 含双G 基因的LEP 全长基因组cDNA 克隆的构建和重组病毒的拯救  61-62
    4.2.2 病毒体外生长特性  62-63
    4.2.3 对小鼠的致病性  63-64
    4.2.4 免疫保护试验  64-65
  4.3 讨论  65-67
第五章全文结论  67-68
参考文献  68-78
附录  78-86
致谢  86-87
作者简历  87

狂犬病Flury病毒致弱分子机制及新型疫苗的研究

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