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肺癌呼气特征性VOCs的筛选及诊断价值研究

作　者: 胡燕婕
导　师: 应可净
学　校: 浙江大学
专　业: 内科学
关键词: 挥发性有机化合物肺癌固相微萃取气相色谱质谱联用仪呼吸试验
分类号: R734.2
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

肺癌是对人类健康构成威胁最大的恶性肿瘤之一,在我国的发病率呈上升趋势,目前在我国城市中肺癌的发病率和死亡率位居肿瘤之首,其总体5年生存率不足15%。但如能早期诊断并及时进行手术治疗,Ⅰ期肺癌患者的5年生存率可达88%。呼吸试验(breath test)通过检测人体呼出气体内相关成分的改变,反映相应组织细胞的代谢情况,从而对疾病的发病等情况作出判断,有望成为一种新型、无创、便捷的诊断手段。而就发生部位而言,发生于支气管树和肺泡上皮的肺癌是与呼吸气体最密切相关的肿瘤,因此积极寻找肺癌相关的特征性VOCs,可能为肺癌的早期诊断提供新的思路与靶标。本研究比较了不同检测系统分析肺癌患者呼出气体中特征性VOCs的优劣,并择优选择最佳分析方法,以肺癌患者为研究对象,肺良性疾病患者和正常健康人作为对照,研究其呼出气体中VOCs的表达差异,最终筛选出肺癌特征性呼吸VOCs标志物作为我们进行肺癌早期诊断的候选靶标,进一步建立肺癌呼吸诊断模型,探索其在肺癌早期诊断中的价值,同时在组织细胞水平进行验证。本研究证实了SPME联合GCMS检测分析患者呼吸气体中特征性VOCs结果稳定,重复性良好,且优于SPME联合GC、Tenxa-TA的热解析联合GC系统。并利用上述SPME-GCMS系统分析了88例肺癌患者、70例肺良性疾病患者、85例正常健康人呼出气体中VOCs的表达谱,并进一步利用聚合分析、逐步判别分析等统计学方法研究了基于不同特征性VOCs组合的诊断模型的灵敏度和特异度。最终选取年龄以及十六醛、十九醇、2,6-二甲基萘等4-9个VOCs组成不同的肺癌诊断模型,其敏感性、特异性基本可达到85%以上。以十六醛、十九醇、邻苯二乙酸二丁酯、2,6-二叔丁基苯甲醇、2,6-二甲基萘、年龄组成的函数为例,其诊断肺癌的特异性为94.9%,78.7%早期肺癌患者被识别为肺癌患者,但其中31.9%被误判为晚期肺癌。因此此类诊断函数可早期诊断肺癌,但在区分早期、晚期肺癌患者上效果不佳,提示肺癌的呼吸诊断模型可作为肺癌高危人群的筛查、早期预警手段之一,但其结果与肺癌临床TMN分期吻合性欠佳。此外,本实验发现部分特征性VOCs的表达与病理分型、病灶部位、手术、吸烟状态有关。相对于呼吸气体检测在肺癌人群中的应用研究和相关特征性气体标志物的发现,其在组织细胞水平上的研究仍处于起步阶段。基于细胞水平的呼吸气体检测和气体标志物相关研究目前仍较少且所得结果差异较大,而组织学水平上的相关研究,目前尚无报道。本研究以肺癌组织和肺癌细胞株为研究对象,以正常肺组织和正常支气管上皮细胞株作为对照,利用SPME联合GC-MS检测技术,研究肺癌与正常对照之间在组织细胞水平上VOCs表达的差异,以期探索肺癌特征性VOCs的产生机制。我们共检测分析18例原发性肺癌患者的手术标本及A549、NCI-H446、SK-MES-1、BEAS-2B 4种细胞株培养液顶空气体中的VOCs,结果发现：2-十五烷酮和十九烷在肺癌细胞株A549、NCI-H446、SK-MES-1中均有表达,2-十五烷酮的表达量分别为(1.382±0.171)×10-5mg/L、(1.681±0.190)×10-4 mg/L和(2.835±0.401)×10-6 mg／L；十九烷的表达量分别为(8.382±0.606)×10-6mg／L、(1.845±0.130)×10-5mg／L和(6.220±0.362)×10-6mg／L；二十烷在肺癌细胞株A549和NCI-H446中有表达,表达量分别为(8.313±1.130)×10-6mg／L、(1.020±0.141)×10-5mg／L；而此3种VOCs在对照组BEAS-2B中均无表达。在18例肺癌组织中,癸烷、2-十五烷酮、十九烷、二十烷等12种VOCs较正常肺组织高表达,其中2-十五烷酮的表达量为5.421×10-6～3.621×10-5mg／L,十九烷为5.805×10-6～1.830×10-5mg／L,二十烷为2.730×10-6～2.343×10-5mg／L,其表达水平与肿瘤分化程度无关(P>0.05)。二十烷在非鳞癌中的表达高于鳞癌,此结果与肺癌细胞株的表达情况相符。本研究进一步分析了肺癌患者群体中筛选出的特征性VOCs与肺癌组织细胞水平中筛选出的特征性VOCs(如2-十五烷酮、十九烷、二十烷等)之间的关系。结果表明,仅2-十五烷酮在肺癌患者呼出气体有特征性的表达,其余组织细胞水平特征性VOCs与呼吸水平不相符,提示呼吸气体中特征性VOCs的代谢产生并非由肿瘤局部代谢产生这一单一因素主导,更倾向于肿瘤引起机体全身代谢改变等多因素共同参与。本研究在国内首次提出建立基于呼出气中VOCs检测的肺癌诊断模型,其特异性、敏感性可达85%以上,并首次在组织水平进行了验证,结果发现两者之间不完全一致。上述结果提示肺癌的呼出气VOCs诊断模型可作为高危人群的筛查、早期预警手段之一。当然,上述诊断模型在肺癌早期诊断中的价值有待进一步扩大样本量、提高检测系统灵敏度等进一步评估。同时呼吸VOCs的代谢路径的机制探讨将成为后期研究的重点,这将为特征性VOCs在肺癌的早期诊断提供科学的实验基础。

全文目录

致谢  5-6
摘要  6-9
Abstract  9-13
缩略语  13-14
目次  14-16
第一部分肺癌患者呼出气体中特征性VOCs的检测与分析  16-72
  1 引言  16-19
  2 肺癌患者呼出气体中特征性VOCs的检测与分析(SPME联合GC)  19-32
    2.1 实验方案  19-20
    2.2 实验对象  20-22
    2.3 实验材料与方法  22-27
    2.4 实验结果与分析  27-30
    2.5 本章小结  30-32
  3 肺癌患者呼出气体中特征性VOCs的检测与分析(热解析仪联合GC)  32-39
    3.1 实验方案  32-33
    3.2 实验对象  33
    3.3 实验材料与方法  33-35
    3.4 实验结果与分析  35-38
    3.5 本章小结  38-39
  4 肺癌患者呼出气体中特征性VOCs的检测与分析(SPME联合GCMS)  39-63
    4.1 实验方案  39-40
    4.2 实验对象  40-42
    4.3 实验材料与方法  42-43
    4.4 实验结果与分析  43-61
    4.5 本章小结  61-63
  5 讨论  63-68
    5.1 不同检测系统分析肺癌患者呼出气体中特征性VOCs的结果比较  63-64
    5.2 本实验建立的肺癌呼吸诊断模型  64-66
    5.3 肺癌呼吸气体中VOCs产生机制的探讨  66-68
  6 参考文献  68-72
第二部分肺癌组织和癌细胞株中特征性VOCs的检测与分析  72-108
  1 背景  72-74
  2 肺癌细胞株、组织培养  74-79
    2.1 标本来源  74-75
    2.2 试剂与器械  75
    2.3 肺癌细胞株、肺癌组织的培养方法  75-79
  3 肺癌细胞组织代谢产物的检测  79-87
    3.1 试剂与仪器  79
    3.2 细胞组织代谢产物的预富集——固相微萃取技术  79-84
    3.3 细胞组织代谢产物的检测——气相色谱质谱联用仪  84-85
    3.4 细胞组织代谢产物的定量分析——标准曲线的制作  85-87
  4 实验方案  87-89
    4.1 实验目的  87
    4.2 实验对象  87-88
    4.3 实验流程  88-89
  5 实验结果及分析  89-101
    5.1 肺癌细胞株特征性VOCs的表达  89-91
    5.2 肺癌组织中特征性VOCs的表达  91-98
    5.3 肺癌细胞组织特征性VOCs与肺癌患者呼出气体中特征性VOCs的相关性分析  98-101
  6 本章小结  101-102
  7 讨论  102-105
  8 参考文献  105-108
结论与展望  108-111
综述  111-127
作者简历及在学期间所取得的科研成果  127-128

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