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虫害马尾松邻株信号通讯及茉莉酸甲酯诱导的蛋白表达差异研究

作　者: 胡永建
导　师: 金幼菊
学　校: 北京林业大学
专　业: 植物学
关键词: 马尾松挥发物内源信号系统性防御邻株通讯蛋白组学外标定量
分类号: S763.7
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

马尾松(Pinus massoniana)是我国南部特有乡土树种,面积居全国针叶林首位,在荒山造林及采脂中发挥着重要的生态效益和经济价值。但常遭受马尾松毛虫(Dendrolimus Punctatus Walker)的危害,猖獗年份针叶全部食尽,给林业带来巨大损失。为解释马尾松毛虫周期爆发的机理,发挥森林生态系统自主调节作用,完善害虫综合治理策略,本文从马尾松诱导防御角度进行了以下几个方面的研究。1)用扫描电镜观察了马尾松毛虫危害后马尾松针叶横切面树脂道变化,发现针叶树脂道中有许多紧密排列、且不易挥发的白色颗粒状树小球,推测其为二萜酸类物质,表明马尾松诱导防御反应中物理抗性增强。同时,单萜类具有与其相同的丙酮酸／3-磷酸甘油醛代谢途径,间接说明虫害后起主要防御作用的萜烯类挥发物通过重新合成来发挥其重要生态功能。2)对盆栽马尾松接虫咬食处理后,通过TCT-GC／MS分析了同株中未受害轮枝针叶挥发物成分及相对含量的时序变化。结果表明,与对照相比,挥发物组分相同,但多数挥发物相对含量变化显著,萜烯类化合物如莰烯、4(10)-宁烯、β-蒎烯、p-散花烯、柠檬烯、β-水芹烯、β-石竹烯、α-石竹烯、罗汉柏烯和含氧化合物辛醛、壬醛、癸醛、冰片乙酯、戊二烯二丁酯等的相对含量都有明显的时序变化。另外,邻枝针叶内源茉莉酸含量测定结果显示,茉莉酸含量在2h显著高于对照,与受害枝的内源茉莉酸相比,具有滞后性。表明虫害后马尾松的伤信号可以从受害部位传递至周围邻枝,引起整个植株产生防御反应。茉莉酸在调节挥发物的系统诱导防御中起重要作用。3)通过自制密闭玻璃箱对虫害马尾松邻株针叶挥发物及信号物质进行研究。结果表明,在感受到虫害株释放的伤信号后,健康马尾松针叶茉莉酸含量迅速增加,并在48h达到高峰,72h降至正常水平。脂氧合酶是茉莉酸合成途径中的关键酶,在虫害邻株针叶中,其活性呈先升高后回落的趋势,且在12h达到最高,与内源茉莉酸的变化相一致。水杨酸在处理后所测各点始终高于对照,12h达到峰值。ABA方差分析差异不显著。4)在上述研究的基础上,进一步持续检测了密闭环境中可能的报警信号及邻株健康马尾松挥发物的时序变化。结果表明,箱体中没有检测到茉莉酸甲酯,但却检测到乙烯的存在,在处理的10h内一直维持在5μg／L左右。邻株挥发物的成分与对照相同,但相对含量差异显著。多数挥发物的相对含量在处理后就有所升高,在24h或36h达到峰值。初步证明虫害马尾松与相邻健康马尾松之间存在明显的化学通讯,邻株能够迅速感知虫害株挥发物指纹图的改变,并产生相应的防御功能。邻株马尾松激发了茉莉酸信号途径,且与乙烯、水杨酸表现出协同作用,共同调节挥发物的变化。5)为了深入了解茉莉酸对马尾松防御相关蛋白调节机制,通过外源茉莉酸甲酯喷施处理,利用蛋白质双向电泳及生物质谱技术,首次研究了处理前后蛋白表达的差异。胶图结果显示,蛋白主要集中在pH4-7的区间内,分子量从15-82kD。从中找出56个差异点,处理后9个蛋白点丢失,新合成27个,其余20个差异显著的蛋白点中,11个表达上调,9个下调。生物质谱鉴定出21个差异蛋白,以1,5-二磷酸核酮糖羧化酶为主,在诱导防御中的能量供给上发挥重要作用。同时,通过优化提取试剂,挑选最适pH范围的等电聚焦胶条等,成功建立了适合马尾松针叶蛋白样品的提取方法及电泳条件,为马尾松蛋白质组学研究奠定了良好的基础。6)模拟吸附热解析方式,首次通过ATD-GC/MS建立了常见挥发物的外标定量曲线,并对其条件进行了优化,即直接进样方式、流速50±3ml／min、干吹时间1min、温度50℃,当标准化合物含量在几十pg～几百ng之间时,其线性范围最佳。这一研究弥补了热脱附所测挥发物的绝对定量问题,为今后挥发物定量提供了科学依据。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-12
1 研究综述  12-32
  1.1 植物快速诱导抗虫性及其信号转导机制研究进展  12-21
    1.1.1 昆虫取食后植物的快速诱导抗性反应  12-18
      1.1.1.1 植物直接防御反应  12-17
      1.1.1.2 害虫对植物直接防御的反适应  17-18
    1.1.2 昆虫取食诱导的植物间接防御反应  18-21
      1.1.2.1 昆虫取食诱导的挥发性化合物  18-19
      1.1.2.2 植物挥发性物质对天敌引诱作用  19-20
      1.1.2.3 来自植食性昆虫的化学诱导物  20-21
    1.1.3 植物诱导防御反应的代价  21
  1.2 虫害胁迫下植物快速诱导抗性反应的信号转导机制  21-28
    1.2.1 参与快速诱导反应的信号分子  22-27
    1.2.2 防御反应中几种信号途径的相互作用  27-28
  1.3 小结  28-29
  1.4 本研究的思路及内容  29-32
    1.4.1 研究背景  29-30
    1.4.2 研究目的和总体思路  30
    1.4.3 研究的主要内容  30-32
2 马尾松针叶挥发物的收集与分析定量方法研究  32-47
  2.1 马尾松针叶挥发物的收集方法  32-34
    2.1.1 马尾松挥发物收集的准备工作  32-34
      2.1.1.1 采样袋  32
      2.1.1.2 大气采样器  32-33
      2.1.1.3 采集植物挥发物的吸附剂材料  33
      2.1.1.4 植物挥发物采集后吸附剂处理  33-34
  2.2 活体植物挥发物采集的基本步骤  34
  2.3 活体植物挥发物的分析鉴定  34-46
    2.3.1 活体植物挥发物的分析条件  35
      2.3.1.1 TCT条件  35
      2.3.1.2 GC的工作条件  35
      2.3.1.3 MS的工作条件  35
    2.3.2 活体植物挥发物的定性与定量分析  35-36
    2.3.3 常见植物挥发物外标定量方法的建立  36-46
      2.3.3.1 外标法所用标准品名称及其浓度配制  36-38
      2.3.3.2 标准曲线线性范围及条件优化  38-43
      2.3.3.3 标样的测定条件  43
      2.3.3.4 各类标样的标准曲线  43-46
  2.4 小结  46-47
3 受害马尾松针叶横切面扫描电镜观察  47-51
  3.1. 材料与方法  47
    3.1.1. 植物与虫源  47
    3.1.2 仪器  47
    3.1.3 样品处理方法  47
  3.2 结果  47-49
  3.3 小结与讨论  49-51
4 虫害马尾松邻枝挥发物及茉莉酸信号的研究  51-61
  4.1 材料和方法  51-54
    4.1.1 植物材料与虫源  51
    4.1.2 马尾松针叶挥发物的采集  51-52
    4.1.3 挥发物的测定  52
      4.1.3.1 TCT-GC/MS仪器  52
      4.1.3.2 仪器的工作条件  52
      4.1.3.3 挥发性物质的鉴定  52
    4.1.4 内源茉莉酸的提取制备  52-53
    4.1.5 茉莉酸的定性和定量分析  53-54
    4.1.6 统计分析  54
  4.2 结果与分析  54-58
    4.2.1 受害马尾松邻枝挥发物的快速变化  54-57
    4.2.2 受害马尾松邻枝内源茉莉酸含量的变化  57-58
  4.3 小结与讨论  58-61
5 虫害马尾松邻株挥发物及其信号物质的研究  61-76
  5.1 材料和方法  61-64
    5.1.1 植物材料与虫源  61
    5.1.2 健康与虫害马尾松的处理  61-62
      5.1.2.1 密闭环境的建立  61
      5.1.2.2 马尾松的处理  61-62
    5.1.3 挥发物的测定及其分析鉴定  62
    5.1.4 内源茉莉酸的提取与分析鉴定  62
    5.1.5 脱落酸样品的提取与分析鉴定  62-63
      5.1.5.1 脱落酸样品的制备  62
      5.1.5.2 脱落酸的定性分析和定量分析  62-63
    5.1.6 游离水杨酸的提取与测定  63
      5.1.6.1 水杨酸样品的制备  63
      5.1.6.2 仪器与试剂  63
      5.1.6.3 HPLC测定条件  63
      5.1.6.4 水杨酸的定性与定量  63
    5.1.7 玻璃箱内乙烯的测定  63-64
      5.1.7.1 烯的收集  63-64
      5.1.7.2 烯的测定  64
    5.1.8 邻株脂氧合酶活性的测定  64
      5.1.8.1 样品处理  64
      5.1.8.2 酶活测定  64
  5.2 结果与分析  64-72
    5.2.1 虫害马尾松邻株挥发物的时序变化  64-67
    5.2.2 虫害马尾松邻株信号物质时序变化  67-72
      5.2.2.1 虫害马尾松邻株茉莉酸及其脂氧合酶时序化  67-69
      5.2.2.2 虫害马尾松邻株脱落酸时序变化  69-70
      5.2.2.3 虫害马尾松邻株水杨酸时序变化  70-71
      5.2.2.4 虫害马尾松邻株箱体内乙烯时序变化  71-72
  5.3 小结与讨论  72-76
6 茉莉酸甲酯喷施马尾松针叶蛋白表达差异研究  76-92
  6.1 材料和方法  76-81
    6.1.1 植物材料  76
    6.1.2 茉莉酸甲酯的配制  76
    6.1.3 外源茉莉酸甲酯对马尾松处理方式  76
    6.1.4 蛋白双向电泳所需仪器、药品与试剂  76-79
      6.1.4.1 蛋白双向电泳所需仪器  76-77
      6.1.4.2 蛋白提取及双向电泳所需药品  77
      6.1.4.3 蛋白双向电泳所需试剂  77
      6.1.4.4 马尾松蛋白提取方法  77-78
      6.1.4.5 双向电泳步骤  78-79
    6.1.5 蛋白点质谱鉴定  79-81
  6.2 结果与分析  81-90
    6.2.1 马尾松针叶蛋白提取优化及双向电泳胶条pH的确定  81-83
    6.2.2 马尾松针叶双向电泳图谱分析  83-88
    6.2.3 差异蛋白点的质谱鉴定  88-90
    6.2.4 差异蛋白质的功能分析  90
  6.3 小结  90-92
7 讨论与结论  92-97
  7.1 讨论  92-95
  7.2 结论  95-97
参考文献  97-110
作者简介  110-111
导师简介  111-112
博士学位在读期间获得成果目录清单  112-113
致谢  113

虫害马尾松邻株信号通讯及茉莉酸甲酯诱导的蛋白表达差异研究

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