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成纤维细胞与完全脱细胞人羊膜的三维黏附

作　者: 卢旭亚
导　师: 雪原
学　校: 天津医科大学
专　业: 外科学
关键词: 羊膜细胞黏附整合素类成纤维细胞 3D黏附
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的：桩蛋白和α5整合素在含有纤维结合蛋白的细胞外纤维中形成共聚现象,这种独特的分子结构我们称之为3D黏附(3D-matrix adhesion)。细胞在3D黏附下其细胞形态、移动方式、信号通路和生存时间都表现出和传统二维培养下完全不同的情况。TAHAM作为一种全新方法获得的自然衍生基质,本实验观察其与成纤维细胞在体外的黏附方式。方法：通过组织贴片法获得原代人包皮成纤维细胞(human foreskin fibroblast, HFF),将HFF分别种植于平片、基质胶及用胰酶悬吊法制作的TAHAM;用光学显微镜、扫描电子显微镜、免疫组织化学和免疫荧光染色观察TAHAM的光学结构、纤维结构及Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ型胶原、纤维结合蛋白、层黏连蛋白、转化生长因子-β1、转化生长因子-β2、成纤维细胞生长因子的分布情况；采用双苯甲亚胺进行新鲜羊膜和TAHAM的DNA定量分析；生物力学试验机上检测TAHAM的应力、应变;用倒置相差显微镜观察HFF在平片、基质胶及TAHAM上的细胞形态并观察细胞在上述三种基质上的移动方式和速度；激光共聚焦显微镜观察α5整合素、桩蛋白和纤维结合蛋白三种分子的空间关系。结果：光学显微镜下新鲜羊膜包含五层结构：上皮层细胞层、基底膜、致密层、纤维母细胞层和海绵层。TAHAM仅保留基底膜和致密层及部分纤维母细胞层,其内未见细胞。扫描电镜下TAHAM基质层表面为方向不一的胶原纤维,纤维粗细不均,纤维走形深浅穿梭,形成立体网状结构,未见细胞及碎屑。免疫组织化学和免疫荧光观察显示Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ型胶原、层黏连蛋白、纤维结合蛋白染色阳性。转化生长因子-β1、转化生长因子-β2、成纤维细胞生长因子染色阴性。双苯甲亚胺证实TAHAM表面无细胞及碎屑残留。新鲜羊膜和TAHAM的过渡应力、过渡应变、破坏应力、破坏应变比较P值>0.05,差异无统计学意义(过渡应力：t=-1.83,P＝0.08；过渡应变：t=-1.07,P=0.30；破坏应力：t=1.57,P=0.13；破坏应变：t=-1.81,P=0.08)。HFF在TAHAM上24h贴壁后,细胞向两极伸展为纺锤形并形成伪足,α5整合素沿细胞长轴分布,此时细胞也分泌出大量的纤维结合蛋白。此后细胞继续增殖为复层细胞团,细胞团之间由细胞组成的条索相互连接,形成海星状结构,在细胞团块底部一些细胞长入TAHAM,不经传代存活21d。HFF中的α5整合素(绿色)、桩蛋白(红色)和HFF分泌的纤维结合蛋白(蓝色),三色共聚焦形成白色条带。在平片和基质胶上未观察到共聚焦现象。HFF种植在TAHAM上8-14 h后细胞移动速度可达12μm/h,当细胞在原位形成细胞团块时移动速度接近0μm/h。在TAHAM上细胞的移动轨迹接近直线,而在普通培养皿上的细胞移动为无序随意运动,移动速度为16～48μm/h。结论：TAHAM保留了羊膜的原有主要成分和力学特征,HFF可在TAHAM上形成3D黏附,其细胞形态及细胞移动方式符合3D黏附特征。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-9
缩略语/符号说明  9-10
前言  10-14
  研究现状、成果  10-13
  研究目的、方法  13-14
成纤维细胞与完全脱细胞人羊膜的三维黏附  14-34
  材料和方法  14-20
  结果  20-26
  讨论  26-34
结论  34-35
参考文献  35-42
发表论文和参加科研情况说明  42-43
附录  43-49
综述成纤维细胞在自然三维基质的生物行为研究进展  49-66
  综述参考文献  60-66
致谢  66

成纤维细胞与完全脱细胞人羊膜的三维黏附

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