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C6细胞系内脑肿瘤干细胞的分离、培养及移植瘤内分布特点研究

作　者: 周旭东
导　师: 李新钢；李刚
学　校: 山东大学
专　业: 外科学
关键词: 肿瘤干细胞 C6大鼠胶质瘤细胞系 CD133 Nestin 分布
分类号: R739.4
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

研究背景恶性胶质瘤是最常见的成人脑肿瘤,约占所有成人脑肿瘤的40%。高分级的胶质瘤患者五年生存率低于3%,中位生存时间小于一年。虽然外科手术和其他治疗措施进展很快,但仍很难治愈。经手术、放疗和化疗后,病人几乎无一例外地出现肿瘤复发。近来,许多研究者先后在肿瘤中发现了具有干细胞特性的细胞,提出了肿瘤干细胞（cancer stem cell,CSCs）的概念,认为在肿瘤细胞中有一小部分细胞具有自我更新、无限增殖、多向分化潜能的干细胞样特性,它们是肿瘤发生,转移和复发的根源。而肿瘤中的绝大部分细胞不具有上述特性,无法独立在体内形成种植性肿瘤。肿瘤干细胞最早是在白血病中发现,后来相继在乳腺癌、多发性骨髓瘤,前列腺癌以及胰腺癌中分离并证实,为研究胶质瘤提供了一个新的思路,为今后的靶向治疗奠定了基础。神经系统的肿瘤干细胞,最早报道的是Ignatova和Singh等,他们将脑胶质瘤细胞在神经干细胞（Neural stem cells,NSC）培养条件下进行培养,分离了一类具有自我更新能力及多向分化潜能的细胞,称之为脑肿瘤干细胞（brain tumor stem cell,BTSC）。这类细胞的特点是可表达神经干细胞的特异性细胞标志—CD133和神经巢蛋白（Nestin）。Singh等还发现,仅10²个CD133+细胞就可以在免疫缺陷小鼠的额叶形成肿瘤,而接种10⁵个CD133-细胞仅在注射部位形成了一条胶质疤痕。某些脑肿瘤干细胞能特征性的表达ABC转运体（ATP-binding cassette）,该转运体能将多种药物转运出细胞外,从而对化疗产生耐药;而某些脑肿瘤干细胞具有很强的修复DNA损伤的能力,从而对放疗产生抵抗。基于肿瘤干细胞与非干细胞肿瘤细胞在致瘤性以及放化疗抵抗能力上的差别,Singh等提出了源于CSCs的肿瘤生成模式:少量正常细胞由于基因突变等原因转化为CSCs,CSCs通过对称和不对称分裂,分别产生少量的子代CSCs和大量的肿瘤细胞,这种分裂方式持续进行直至形成肿块。肿块中的CSCs所占比例较小,多数为CD133-的肿瘤细胞,这种模式说明肿瘤中始终存在一定数量的CSCs,尽管数量可能较少,但它们在肿瘤的发生、发展、侵袭、转移、复发和治疗敏感性中起关键性的作用。作为经典的胶质瘤模型,多年来C6大鼠胶质瘤细胞系被广泛应用于胶质瘤的实验研究。但是C6胶质瘤细胞系内肿瘤干细胞的分离、培养方法以及肿瘤干细胞所占的比例一直存在争议。Toru Kondo等应用一种复杂的无血清DMEM培养基对C6细胞系内的CSCs进行分离培养,并指出其中CSCs的比例约为0.4%。但Xuesheng Zheng等应用单克隆研究,提出了C6细胞系中大部分细胞都是CSCs的观点。同时,虽然越来越多的研究指出CSCs参与肿瘤的血管生成,肿瘤形成、侵袭以及复发,从而可以作为靶向治疗的新的靶点,但尚未有对于瘤体内肿瘤干细胞分布位置及分布特点的研究报道。在本实验中,我们应用简化的无血清DMEM培养基对C6细胞系进行培养,对其中的CSCs进行了分离与鉴定,并测定了其内CSCs所占的比例;建立了裸鼠皮下C6胶质瘤致瘤模型,并研究了移植瘤内CSCs的分布特点;提出了肿瘤内CSCs的“爆炸式”分布假说,从形态学上,为CSCs参与肿瘤形成、侵袭以及复发提供了新的证据,为以CSCs为靶点的靶向治疗提供了定位依据。目的1.分离、培养C6细胞系内的脑肿瘤干细胞,并对其进行鉴定,测定C6细胞系内脑肿瘤干细胞所占的比例。2.建立裸鼠皮下C6胶质瘤载瘤模型,查找其中的肿瘤干细胞。3.研究C6移植瘤内肿瘤干细胞的分布特点。方法1.C6细胞系中的脑肿瘤干细胞的分离培养与传代先将C6细胞系接种于传统含血清培养基中,在37℃、5%CO₂、饱和湿度培养箱中培养。待细胞处于对数生长期,用PBS清洗,0.25%胰酶消化,自制巴斯德吸管机械吹打成单细胞悬液,重悬于添加了表皮生长因子和碱性成纤维生长因子的无血清培养基,待细胞增殖形成肿瘤细胞球4—5天后,在超净工作台内将细胞团连同培养基一起转移至试管内,以800r/min离心10min,弃上清。无血清培养基重悬细胞,自制巴斯德尖嘴吸管反复吹打,制成单细胞悬液,按1:2或者1:3的比例接种于25cm²底面积培养瓶,添加无血清培养基至6ml;或以相同浓度接种于标准6孔板,每孔加无血清培养基2.5ml,继续在37℃、5%CO₂、饱和湿度培养箱中培养。2.C6细胞系中的脑肿瘤干细胞的鉴定以CD133和Nestin为标记,应用免疫荧光技术对普通含血清培养基中的C6细胞和无血清培养基中形成的肿瘤细胞球进行鉴定。取含血清培养基中处于对数生长期的C6细胞,胰酶消化后,调整细胞密度为5×10⁵/ml,接种于放置强酸过夜浸泡的载波片的六孔板内,爬片过夜后,将细胞爬片用4.0%多聚甲醛固定。取无血清培养基培养的肿瘤细胞球悬液,离心后滴于0.01%多聚赖氨酸溶液包被的载玻片上,静置待干,4.0%多聚甲醛固定。10%山羊血清封闭。抗CD133或抗Nestin抗体孵育4℃过夜,添加荧光素标记二抗孵育37℃20min,每步骤间均用0.01MPBS冲洗3遍。封片后置荧光显微镜下观察。3.C6细胞系中的脑肿瘤干细胞所占比例的测定应用Nestin标记的流式细胞术检测C6细胞系中的脑肿瘤干细胞所占的比例。取处于对数生长期的C6细胞,胰酶消化后,调整细胞密度为1×10⁷/ml,取10个样本,每个样本100μl,分别加入TRITC标记的抗鼠Nestin抗体后,于暗处孵育30分钟。设不加抗鼠Nestin抗体的阴性对照10个,分别上机检测每个样本中脑肿瘤干细胞的比例。4.裸鼠皮下C6胶质瘤载瘤模型的建立取处于对数生长期的C6细胞,胰酶消化后,调整细胞密度为1×10⁶/ml。抽取细胞悬液100μl,接种于裸鼠双侧腋下或股部皮下。定期观察裸鼠皮下肿瘤生长情况,以及体重、精神、饮食、排便等情况。每隔5天测量移植瘤的最长径（a）和最短径（b）,按公式V=ab²×π/6计算肿瘤体积,绘制生长曲线。待移植40天后,脱颈处死裸鼠,切开移植部位皮肤,手术显微镜下观察移植瘤生长情况并将其完整分离。5.移植瘤内肿瘤干细胞的分布特点研究（1）将肿瘤标本做连续石蜡切片,应用CD133或Nestin标记的免疫荧光及免疫组化技术查找肿瘤组织内的肿瘤干细胞,直观观察其内肿瘤干细胞的分布位置及分布方式。（2）取新鲜肿瘤瘤体最大剖面处做厚度0.5cm的切片,由瘤体中心至外缘均分成5部分,显微手术器械分割,所得的5个样本,采用机械研磨法处理,研磨后200目滤网过滤除去细胞团快,所得的单细胞悬液调整细胞密度为1×10⁷/ml,CD133标记后,上机检测自瘤体中心至瘤体边缘不同部位脑肿瘤干细胞的比例。结果1.无血清培养基中脑肿瘤干细胞球的形成使用传统含血清培养基进行培养的C6细胞,呈贴壁生长,接种到无血清培养基后1小时,呈单个细胞悬浮生长;接种后24小时,小的肿瘤干细胞球形成;接种48小时后形成典型的肿瘤干细胞球,细胞球呈圆形或卵圆形,大小不一,折光性较强,悬浮生长。2.C6细胞系中脑肿瘤干细球的鉴定含血清培养基中贴壁生长的C6细胞爬片进行的免疫荧光,可以查见散在分布的CD133与Nestin表达阳性的细胞。无血清培养基中形成的肿瘤干细胞球进行的免疫荧光显示呈CD133与Nestin的强阳性表达。3.流式细胞术检测C6细胞系内肿瘤干细胞比例的结果Nestin标记流式细胞术可检出C6细胞系内的脑肿瘤干细胞,10例样本内测得的所含脑肿瘤干细胞的比例在4%左右。统计学分析表明,所测10个样本中脑肿瘤干细胞的比例为4.02±0.04%,95%可信区间为3.93—4.10%。4.移植致瘤实验本实验所用20只裸鼠,均在注射部位形成了肿瘤,致瘤潜伏期为4—6天,肿瘤体积呈指数生长。移植致瘤后40天被处死时,瘤体最长径为1.7—2.0cm。5.移植瘤内肿瘤干细胞的分布特点（1）肿瘤组织的免疫组化与免疫荧光结果以肿瘤干细胞的表面标志CD133与Nestin为指标,对肿瘤组织中的肿瘤干细胞进行鉴定和定位,可见典型的阳性分布,其在瘤体内的分布,主要有以下三种方式:散在的单个阳性细胞,巢状分布和条带状分布。这三种分布方式在瘤体内的分布也有一定的特点,即在肿瘤的中心,阳性细胞很少,即使有,也多是散在的单个细胞,并且多围绕在小血管的周围;在靠外侧的肿瘤基质内,可以看到巢状和条带状分布;而在肿瘤的周边或者边缘区域,多是带状分布,并且越接近肿瘤的边缘,阳性细胞的密度越大。在比较典型的视野中,可以找到呈分层排列的肿瘤干细胞带,在肿瘤边缘可见包裹有一层密集的肿瘤干细胞。（2）流式细胞术检测自瘤体中心至瘤体边缘不同部位脑肿瘤干细胞比例的结果肿瘤中心部位脑肿瘤干细胞比例为0.90±0.01%,而边缘部位比例为9.81±0.04%。经oneway-anova分析,结果显示,在由肿瘤中心至肿瘤边缘的组织中,肿瘤干细胞比例呈现线性增高趋势。结论1.C6细胞系内存在比例约为4.02%的CD133和Nestin表达阳性的CSCs。简化的无血清培养基可以作为肿瘤干细胞分离、培养的一种有效途径。2.裸鼠皮下C6胶质瘤载瘤模型成瘤稳定,肿瘤生长良好。移植瘤内可查见脑肿瘤干细胞。3.C6胶质瘤瘤体内,脑肿瘤干细胞的分布有三种方式,并呈现由中心向四周放射状逐渐增多的趋势,呈“爆炸式”分布特点。

全文目录

中文摘要  6-11
英文摘要  11-17
符号说明  17-18
第一部分:C6胶质瘤内脑肿瘤干细胞的分离、培养、鉴定与C6胶质瘤裸鼠皮下载瘤模型的建立  18-54
  前言  18-25
  1.材料与方法  25-31
  2.结果  31-33
  3.讨论  33-39
  附图  39-47
  参考文献  47-54
第二部分:C6胶质瘤内脑肿瘤干细胞分布特点实验研究  54-77
  前言  54-55
  1.材料与方法  55-60
  2.结果  60-64
  讨论  64-68
  附图表  68-73
  参考文献  73-77
致谢  77-78
攻读学位期间已发表或待发表的论文  78-79
学位论文评阅及答辩情况表  79-80
外文1  80-96
外文2  96-114
综述  114-125

C6细胞系内脑肿瘤干细胞的分离、培养及移植瘤内分布特点研究

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