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油茶品种对炭疽病的抗性机制研究

作　者: 杨光道
导　师: 束庆龙
学　校: 安徽农业大学
专　业: 森林保护学
关键词: 油茶品种炭疽病抗性机制
分类号: S794.4
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
下　载: 333次
引　用: 2次
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内容摘要

本文分别从形态结构、生理生化、分子生物学和活性物质四个角度系统深入研究了油茶品种对炭疽病的抗性机制,所获主要研究结果报道如下:1.通过对8个油茶品种野外调查及对其材料的反复试验,初步认定攸县油茶、徽州大红、徽州小红、舒城大红4个品种为抗炭疽病品种,其发病率都在10%以下,其中攸县油茶基本不发病;舒城大青、徽州小青2个品种为易感病品种,发病率都在50%以上;而徽州大青、罗汉果则介于这两者之间。2.通过对不同油茶品种果皮相对肿胀度的测定结果表明,相对肿胀度较高的品种一般易感病,反之抗病。如易发病的舒城大青,徽州大青、徽州小青等相对肿胀度都在70%左右;抗病性较强的攸县油茶、徽州小红等相对肿胀度在50%左右。但也存在抗性强的徽州大红含水量反而最高,达到75.69%,舒城大红含水量亦很高,这可能与果皮含有复杂的化学物质,以及所有品种虽然在同一时期采摘,但其品种生长期各不相同等因素有关。3.不同油茶品种果皮浸提液对炭疽病菌孢子的萌发有着较大的影响,且芽管萌发长度也有很大的差异。抗性品种的浸提液对病菌孢子萌发的抑制最强,萌发率在5%以下,芽管萌发长度也最多只有1.8μm左右。孢子萌发率在50%左右的有舒城大红、徽州大红,前者的菌丝生长略比后者多,但都在3.6μm左右;而青果类型,包括罗汉果在内孢子萌发率都在80%以上,其中在徽州大青的浸提液中孢子萌发率达到了100%,这说明青果类型,特别是徽州大青内可能存在大量适宜炭疽菌孢子萌发的物质。同时,利用炭疽病菌的孢子接种果汁培养基的研究结果表明,抗病与感病品种之间差异显著,且这一结果与孢子萌发试验基本一致。4.通过对不同抗病类型油茶品种的叶片结构进行观察测定发现,叶片表皮结构对其抗病性有很大影响,叶片的蜡质层厚度、角质层厚度、栅栏组织厚度、栅栏组织细胞密度与抗病性都呈正相关关系。5.通过对8个油茶品种果皮的6种酚类化合物含量进行测定发现,其中邻苯二酚和对氢基苯甲酸含量与抗炭疽病关系密切,抗病品种其邻苯二酚和对氢基苯甲酸的含量明显偏高,而且比易感病的徽州大青、舒城大青和徽州小青高出近5-10倍。6.对油茶的抗病性与叶、果皮的提取液对DPPH清除率之间的关系进行分析,发现油茶不论叶片还是果皮,在2.0mg/mL的浓度下,对DPPH清除率都达到85%以上,最高达到90%以上;不同抗病等级油茶品种的叶片及果皮提取液对自由基清除能力的差异很大,但与抗病性之间没有呈现出线性相关关系。提取液的浓度与清除率之间、加入DPPH后的保温时间与清除率之间均呈正相关关系。7.通过对不同抗病品种油茶苯丙氨酸解氨酶活性、多酚氧化酶活性、过氧化物酶活性在接种炭疽菌前后进行测定,结果表明在未感病的情况下,这三种酶活性在不同抗病品系中的差异不明显,在接种以后,抗病性越强的品种酶活性上升速度快,变化幅度大,而感病的品种酶活性变化很小或者反应很慢。健康果皮中的多酚氧化酶活性测定结果表明,抗性品种高于感病品种4倍。苯丙氨酸解氨酶活性水平的品种间差异较大,4个易感病品种果皮中的苯丙氨酸解氨酶活性均比较低,平均酶活性仅8021.25酶单位/g,而抗病品种的酶活性比较相近,且明显高于感病品种,平均值高达12896.25酶单位/g。8.不同油茶品种的分子生物学研究表明,油茶的DNA浓度在918μg/ml符合RAPD分析的要求。聚类分析图反映出来源于全国各主要油茶产区的17个样品可以分为5组,其中抗病的和感病的相对较为集中,由此可推测出现这种聚类的原因可能是由它们基因组中有相同的DNA片断。9.通过用高分辨质谱联用法（HPLC-DAD-MS）对三种油茶（Camellia oleiferaAbel.）抗病品种大别山1号、大别山2号和大别山3号的叶子的甲醇和乙酸乙酯混合提取物进行了比较分析,发现在三个抗病油茶品种中,大别山1号的抗性分子可能是C₁₄H₁₄O₃、C₇H₁₂O₆和C₂₉H₄₀O₁₄,2号和3号抗性品种的抗性分子可能是C₇H₁₂O₆和C₂₉H₄₀O₁₄。比较3个抗性品种发现,油茶的抗性是多因子决定的,不同抗性品种的抗性成分不一定完全一样,但最有可能普遍存在的抗性有关分子可能是C₂₉H₄₀O₁₄。10.通过高分辨质谱联用法（HPLC-DAD-MS）对抗病油茶和感病油茶果实的甲醇和乙酸乙酯混合提取物进行比较分析,发现油茶抗病品种和感病品种果实的成分种类和含量都存在着一定的差异。在抗病果实的质谱图上,出现了质荷比分别为577和289的特有离子峰,对应的可能分子式分别为C₂₇H₃₀O₁₄和C₁₅H₁₄O₆。由于这两个离子峰只在抗病品种中出现,所以它们对应的化合物可能与油茶的抗性有关。在感病果实的质谱图上,发现了质荷比分别为173、483、635的离子峰,这些离子峰在抗病果实质谱图上都没有出现,它们可能与油茶的感病有关。通过分析发现,它们对应的可能分子式分别为C₇H₁₀O₅、C₂₄H₂₀O₁₁、C₃₁H₂₄O₁₅。11.通过高分辨质谱联用法（HPLC-DAD-MS）对抗病品种和感病品种油茶叶片的甲醇和乙酸乙酯混合提取物进行比较分析,发现抗病品种和感病品种油茶叶片不论是在色谱图还是在质谱阴离子流图上都有一定差别。抗病油茶叶提取物在7.4min和14.0min时出现了较强的吸收峰,但这两个峰在感病油茶叶提取物的色谱图上都没有出现,感病油茶叶提取物在8.5min时出现了较强的吸收峰。质谱阴离子流图图中,抗病油茶叶提取物阴离子图上,在保留时间为10.5min出现了质荷比为553的离子峰,而在感病油茶叶提取物阴离子图上对应的保留时间没有出现任何离子峰,553离子峰对应的可能分子式分别为C₃₄H₂₃O₇。该物质分子可能与油茶的抗病性有关。12.通过高分辨质谱联用法HPLC-DAD-MS对红果油茶和青果油茶果实的甲醇和乙酸乙酯混合提取物进行比较分析,发现红果油茶与青果油茶果实的成分种类和含量都存在着一定的差异。在红果油茶上有两个特有的离子,对应的质荷比分别为577和289,对应的分子式分别为C₂₇H₃₀O₁₄和C₁₅H₁₄O₆。由于红果通常表现出对油茶炭疽病较强的抗性,该两峰对应的化合物可能与油茶的抗性有关。对青果的分析发现了质荷比分别为331、125、483、635、787的特有阴离子峰,它们对应的可能分子式分别为C₁₇H₁₆O₇、C₆H₆O₃、C₂₄H₂₀O₁₁、C₃₁H₂₄O₁₅和C₃₈H₂₈O₁₉。由于青果品种通常易感病,因此这些化合物可能与油茶的感病因子有关。

全文目录

摘要  3-6
Abstract  6-14
1 文献综述  14-42
  1.1 症状  14-15
  1.2 病原  15-16
  1.3 发病规律  16-18
  1.4 抗病机理  18-40
    1.4.1 林木抗病性表现  20-21
    1.4.2 林木抗病性鉴定  21-22
    1.4.3 形态结构抗病研究  22-26
    1.4.4 生理生化代谢抗病研究  26-31
    1.4.5 化学物质成分抗病研究  31-34
    1.4.6 分子抗病研究  34-38
    1.4.7 RAPD分子标记及其在林木抗病性研究中的应用  38-40
  1.5 本研究的目的与意义  40-42
2 材料与方法  42-51
  2.1 试验材料  42-44
    2.1.1 供试材料  42
    2.1.2 供试药剂  42-43
    2.1.3 仪器设备  43-44
  2.2 试验方法  44-51
    2.2.1 不同油茶品种林间发病率调查  44
    2.2.2 炭疽菌分生孢子的制备  44
    2.2.3 不同油茶品种的果实培养基接种实验  44-45
    2.2.4 不同油茶品种果皮汁液对炭疽菌孢子的萌发抑制试验  45
    2.2.5 叶片结构因子测定方法  45-46
    2.2.6 果皮生化物质  46-47
    2.2.7 酶活性的测定  47-48
    2.2.8 抗病性与清除自由基活性的关系研究方法  48
    2.2.9 不同油茶品种 RAPD研究  48-49
    2.2.10 不同油茶抗感品种叶片和果实成分的分析  49-51
3 结果与分析  51-118
  3.1 不同品种油茶林间自然抗病性比较  51-54
  3.2 不同品种油茶果皮和果汁对接种病菌萌发和生长的影响  54-62
    3.2.1 果皮相对含水量与抗病性的关系  54-55
    3.2.2 果皮浸提液对孢子萌发率的影响  55-58
    3.2.3 果汁培养基对菌落生长的影响  58-62
  3.3 不同抗病类型油茶叶片发育阶段和结构与炭疽病的关系  62-74
    3.3.1 叶龄对炭疽病的侵染影响  62-64
    3.3.2 叶片结构与炭疽病的关系  64-74
  3.4 果实生化特性对炭疽病的抗性影响  74-91
    3.4.1 主要酚类化合物与抗病性的关系  74-76
    3.4.2 黄酮类化合物与抗病性的关系  76-77
    3.4.3 酶活性与抗病性的关系  77-87
    3.4.4 油茶抗病性与自由基清除率之间的关系  87-91
  3.5 不同油茶品种的RAPD分析与抗炭疽病的关系  91-99
    3.5.1 油茶基因组 DNA提纯方法研究  91-92
    3.5.2 油茶基因组 DNA的 PCR扩增反应  92-94
    3.5.3 不同油茶品种遗传差异的RAPD分析  94-99
  3.6 不同抗感油茶品种活性物质成分的分析  99-118
    3.6.1 油茶抗病品种与感病品种果实成分的比较分析  99-103
    3.6.2 红果油茶与青果油茶果实成分的比较分析  103-108
    3.6.3 油茶抗病品种与感病品种叶成分的比较分析  108-112
    3.6.4 三种油茶抗病品种的叶成分的比较分析  112-118
4 讨论  118-129
  4.1 关于油茶炭疽病的防治  118-119
    4.1.1 分级治理  118
    4.1.2 清除病原  118
    4.1.3 药剂防治  118-119
    4.1.4 生物防治  119
    4.1.5 短期预报  119
    4.1.6 选育抗病品种  119
  4.2 关于油茶的品种资源及其分类地位  119-120
  4.3 关于油茶炭疽病的分生孢子在果皮滤液中的萌发试验  120-121
  4.4 关于油茶品种叶片形态结构特征与抗炭疽病之间的关系  121
  4.5 关于油茶品种果皮的生理生化特性与抗炭疽病之间的关系  121-126
  4.6 关于油茶品种的RAPD分析研究  126-127
  4.7 关于油茶品种果实及叶片中抗病活性物质成分的分析  127-129
5 结论与建议  129-132
  5.1 结论  129-131
  5.2 建议  131-132
参考文献  132-146
致谢  146-147
个人简介  147-148
攻读博士学位期间发表的学术论文  148

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