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口服食物抗原诱导的类风湿性关节炎动物模型的建立及评价
作 者: 毋丹丹
导 师: 胡东生;刘志刚
学 校: 郑州大学
专 业: 流行病与卫生统计学
关键词: 类风湿关节炎 食物抗原 肠道通透性 大鼠模型
分类号: R-332
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以慢性、进行性、侵袭性关节炎为主要表现的全身性自身免疫疾病。如果不经过正规治疗,患者病情会逐渐发展,最终导致关节畸形、功能丧失。RA具有很高的致残率,严重影响患者的健康和生活质量,同时也给患者家庭和社会造成巨大的经济负担。众多研究已表明食物与RA的发生密切相关。目前通过皮下注射Ⅱ型胶原蛋白诱导的RA模型是最佳的RA实验动物模型。尽管通过注射的方式能成功有效地诱导大鼠产生类风湿关节炎,但皮下注射的诱导方式并不符合人体摄食模式,其忽略了胃肠道在RA发病中的重要性,使RA发病机制的研究出现了一个极为重要的空白点:即食物抗原在人体摄食过程中如何通过肠上皮粘膜屏障进入肠道粘膜固有层,引起肠道相关免疫组织细胞的一系列免疫应答,扰乱肠粘膜免疫组织的固有与适应性免疫反应,并通过分子拟态和旁观者效应打破免疫耐受,进而导致RA发生的机理。为了深入RA发病机制的研究,建立一种与人RA发病机制及病理相同或相似的动物模型(口服食物抗原诱导的RA动物模型)在RA研究中的作用也就显得尤为重要。目的:建立口服牛Ⅱ型胶原蛋白诱导的RA大鼠模型;确定口服食物抗原与RA的相关性;并在动物模型的基础上,对肠道通透性在食物抗原诱导的RA发病机理中的作用进行初步探索,为临床RA的预防和治疗提供理论依据。方法:本研究选择Wistar大鼠作为实验动物。从牛软骨中提取牛Ⅱ型胶原蛋白,先用阿司匹林破坏大鼠的肠道粘膜屏障功能,然后灌胃给予大鼠较大剂量的牛Ⅱ型胶原蛋白,诱导大鼠类风湿关节炎的发生。将4-5周龄雌性Wistar大鼠随机分成四组:对照组(生理盐水;生理盐水)、M1组(生理盐水;生理盐水+CC14+LPS)、M2组(5mg/kg阿司匹林;牛Ⅱ型胶原蛋白+CC14+LPS)、M3组(10mg/kg阿司匹林;牛Ⅱ型胶原蛋白+CC14+LPS)。在阿司匹林灌胃期间,每七天灌胃给予大鼠一定量的乳果糖和甘露醇,用代谢笼收集大鼠24h尿,高效液相色谱仪(HPLC)检测并计算乳果糖、甘露醇比值(L/M),并将M2组、M3组与对照组相比,间接评价大鼠肠道通透性的变化情况。建模过程中,用游标卡尺测量并记录大鼠右后腿踝关节的直径,两周一次,一共5次,并进行关节指数(AI)评定。建模结束后,取大鼠血清、空肠组织和踝关节组织。采用双抗体夹心ELISA法测定各组大鼠血清中牛Ⅱ型胶原蛋白特异性抗体水平、细胞因子TNF-a、IFN-r和IL-4水平;将所取实验动物的空肠和踝关节组织用固定液固定后,石蜡包埋切片,苏木素-伊红(HE)染色,光学显微镜下观察其病理形态结构的变化以及淋巴细胞浸润渗透的情况;用荧光免疫组织化学的方法,以小鼠来源的牛Ⅱ型胶原蛋白单克隆抗体作为一抗,以FITC标记的山羊抗小鼠的IgG作为二抗,定位空肠中的牛Ⅱ型胶原蛋白,观察其是否能够通过肠粘膜的屏障从而进入肠道粘膜固有层;用荧光免疫组织化学的方法,以小鼠来源的牛Ⅱ型胶原蛋白单克隆抗体作为一抗,以FITC标记的山羊抗小鼠的IgG作为二抗,定位关节滑膜上的牛Ⅱ型胶原蛋白,观察其在关节滑膜上的沉积情况。通过以上指标对所建立的类风湿关节炎大鼠模型进行综合评价。结果:在建模结束后,M2组、M3组大鼠踝关节呈现不同程度的肿胀;M2组、M3组大鼠血清中抗牛Ⅱ型胶原蛋白特异性抗体显著升高(P<0.05),血清中TNF-a和IFN-r水平明显升高(P<0.05),并且IL-4水平明显降低(P<0.05);M2组、M3组大鼠空肠病理学改变明显:肠粘膜损伤严重,粘膜下层中性粒细胞浸润明显,肠绒毛水肿肥大,肠粘膜上皮细胞广泛脱落等;荧光免疫组化显示未经消化的大分子牛Ⅱ型胶原蛋白透过损伤的肠上皮粘膜屏障进入肠道粘膜固有层;在M2组、M3组大鼠踝关节标本组织学中观察到滑膜组织增生,其局部骨吸收破坏明显,软骨表层胶原纤维松解断裂、软骨细胞变性坏死,软骨表面凸凹不平等;并通过荧光免疫组化的方法观察到M2组、M3组大鼠关节滑膜上牛Ⅱ型胶原蛋白的沉积。双糖实验,M2组、M3组大鼠尿中的甘露醇浓度降低(P<0.05),乳果糖浓度升高(P<0.01),L/M升高(P<0.05),说明M2组、M3组大鼠的肠道通透性增加。结论:在肠黏膜损伤的条件下,口服牛Ⅱ型胶原蛋白可成功诱导大鼠产生类风湿关节炎。
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全文目录
摘要 4-6 Abstract 6-14 1 引言 14-16 2 实验材料 16-20 2.1 实验动物 16 2.2 主要试剂 16 2.3 主要溶液的配制 16-18 2.3.1 固定脱钙液(5%硝酸-福尔马林)的配制 16 2.3.2 Bouin固定液的配制 16 2.3.3 Harry's苏木素染色液的配制 16-17 2.3.4 0.5%伊红酒精溶液的配制 17 2.3.5 1%盐酸酒精的配制 17 2.3.6 4%胃蛋白酶修复液的配制 17 2.3.7 封片剂:50%甘油-碳酸盐缓冲液的配制 17 2.3.8 重铬酸钾洗涤液的配制 17 2.3.9 粘附剂:多聚赖氨酸的配制 17-18 2.4 主要仪器设备 18-20 3 实验方法 20-38 3.1 牛Ⅱ型胶原蛋白的粗提与鉴定 20-21 3.1.1 牛Ⅱ型胶原蛋白的粗提 20 3.1.2 SDS-PAGE电泳检测 20-21 3.2 实验动物的分组 21 3.3 RA动物模型的建立 21-23 3.4 标本的采集和处理 23-24 3.5 RA动物模型的评价 24-36 3.5.1 实验动物外观情况的观察与评价 24-25 3.5.2 实验大鼠血清中抗牛Ⅱ型胶原蛋白特异性抗体的检测 25-27 3.5.3 实验大鼠血清中细胞因子的检测 27-29 3.5.4 实验大鼠空肠组织病理切片的制作及病理学观察 29-31 3.5.5 实验大鼠小肠中牛Ⅱ型胶原蛋白的荧光定位 31-33 3.5.6 实验大鼠踝关节组织病理切片的制作及病理学观察 33-35 3.5.7 牛Ⅱ型胶原蛋白在实验大鼠踝关节滑膜上的荧光定位 35-36 3.6 质量控制 36-37 3.7 统计分析 37-38 4 结果 38-49 4.1 肠道通透性的检测(双糖实验)结果 38-40 4.2 实验动物外观情况的观察及评价结果 40-42 4.2.1 一般情况 40 4.2.2 踝关节直径测量结果 40 4.2.3 关节炎指数评分结果 40-41 4.2.4 致病率计算结果 41-42 4.3 实验大鼠血清中抗牛Ⅱ型胶原蛋白特异性抗体的检测 42-43 4.3.1 实验大鼠血清中抗牛Ⅱ型胶原蛋白特异性IgG的检测 42 4.3.2 实验大鼠血清中抗牛Ⅱ型胶原蛋白特异性IgE的检测 42-43 4.4 实验大鼠血清中细胞因子的检测 43-44 4.4.1 实验大鼠血清中TNF-a的检测 43 4.4.2 实验大鼠血清中IFN-r和IL-4的检测 43-44 4.5 实验大鼠空肠的组织病理学观察 44-45 4.6 实验大鼠空肠中牛Ⅱ型胶原蛋白的荧光定位 45-46 4.7 实验大鼠踝关节的组织病理学检测 46-47 4.8 牛Ⅱ型胶原蛋白在实验大鼠关节滑膜上的荧光定位 47-49 5 讨论 49-54 5.1 食物抗原与类风湿关节炎 49 5.2 肠道通透性与RA 49-51 5.3 TNF-a在RA中的生物学作用 51-52 5.4 Th1/Th2细胞因子的失衡在RA中的生物学作用 52-54 6 结论 54-55 参考文献 55-63 综述 63-82 参考文献 76-82 个人简历 82-83 致谢 83
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中图分类: > 医药、卫生 > 医学研究方法 > 实验医学、医学实验 > 医用实验动物学
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