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欧洲黑杨（Populus nigra L.）水、光资源高效利用相关单核苷酸多态性（SNP）研究

作　者: 褚延广
导　师: 苏晓华
学　校: 中国林业科学研究院
专　业: 林木遗传育种
关键词: 欧洲黑杨 水分利用效率 光合利用效率 单核苷酸多态性 关联分析
分类号: S792.11
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


欧洲黑杨（Populus nigra L.）是世界主栽杨树品种重要的基因供体,也在我国杨树遗传改良中起重要作用。我国黑杨派基因资源严重不足,仅新疆北部有少量欧洲黑杨分布。近年来我国已陆续从欧洲15个国家引进了许多欧洲黑杨无性系,极大地丰富了我国欧洲黑杨育种资源。我国是严重缺水的国家,土壤干旱缺水严重限制了杨树的生长和木材生产,提高杨树对水分的利用效率、增强抗旱能力,培育节水抗旱的杨树新品种对木材生产和通过绿化改善环境都具有重要意义。光合作用是影响植物生物量积累的重要因素,充分利用环境的光能资源,提高杨树对光能资源的利用能力,培育具有较高光合利用效率的杨树新品种,是高产杨树人工林培育的重要方向。本研究以从国外引进和我国新疆的欧洲黑杨基因资源为材料,对光合利用效率进行了评价,结合之前对水分利用效率(碳稳定同位素比率,δ13C)的评价结果,从水分与光合利用相关功能基因中进行了单核苷酸多态性（SNP）标记的筛选与分析,通过SNP标记在基因资源中的分型并与水分利用效率、光合生理特征和生长性状进行关联分析,开发与目标性状相关联的功能SNP标记,为杨树水分、光合利用性状分子标记辅助育种提供参考。论文主要研究结果如下:欧洲黑杨水分及光合利用效率评价。由于之前已完成了水分利用效率的评价,本文着重对光合利用效率进行了评价。对气体交换、叶绿素荧光及生长性状的测定与分析证明,欧洲黑杨基因资源的光合生理和生长性状具有丰富的遗传变异;来自我国和英国的无性系具有较高的净光合速率（Pn）,来自匈牙利的无性系叶绿体光系统II（PSII）最大光化学效率（Fv/Fm）最高。各检测参数在欧洲黑杨中具有较高的广义遗传力（H2值在0.7500.962间）且变异系数较高。分析结果发现,Pn、胞间二氧化碳浓度（Ci）、气孔导度（Gs）和PSII电子传递速率（ETR）等参数指标与欧洲黑杨高生长性状显著相关,在光合利用效率评价中具有潜在的应用价值;起源于南欧和东欧的欧洲黑杨可在进一步的杨树高光效育种研究中作为优良基因型选择的重点。欧洲黑杨水分及光合利用相关功能基因SNP的筛选与分析。利用PCR扩增和序列测定,从7个水分利用效率相关基因（SuSY1、dhn、lea3、PIP、Expa1、ERF和GPX1）和2个光合利用效率相关基因（rubisco和Lhcb2）中共筛选出312个SNP位点,SNP频率为1/26 bp。所测序DNA区域的核苷酸多样为θW=0.01074和πT=0.00702,高于欧洲山杨（P. tremula）、毛果杨（P. trichocarpa）和多数针叶树种;进化的中性检测结果表明,目标基因DNA区域以低频率突变为主,其中多数非同义突变可能与欧洲黑杨的适应性进化过程有关;GPX1、dhn、lea3和Expa1基因不符合中性进化原则,可能在进化过程中受到产生遗传搭载效应的选择清除作用。不同基因内的连锁不平衡（LD）水平各不相同;欧洲黑杨总体的LD水平较低,r2值在300 bp的DNA物理距离范围内从0.45降低至0.20以下,该规律与其它多数林木相似,说明欧洲黑杨适合于采用目标基因进行关联分析和功能SNP标记的开发。水分利用效率性状(δ13C值)与SNP标记的关联分析。利用SNaPshot技术对SuSY1、lea3、PIP、Expa1和ERF等5个基因的25个SNP位点进行了分型。采用单因素方差分析（ANOVA）和一般线性模型（GLM）分析,对分型的SNP标记与δ13C值进行了关联分析。结果显示,共有6个SNP标记与欧洲黑杨δ13C值显著关联。SNP2为T-C转换,遗传贡献率为7.705%,基因型为TT的欧洲黑杨具有较高的δ13C值。SNP15为G-A转换,并引起编码氨基酸的变化（Val-Ile）,遗传贡献率为7.570%;GG基因型的欧洲黑杨具有较高的δ13C值。SNP25、SNP26、SNP27和SNP31均位于Expa1基因内,遗传贡献率为6.436%6.900%;这4个位点的纯合、杂合基因型频率均具有相似的分布特征,其中SNP25、SNP27和SNP31的TT基因型所对应个体的δ13C值明显高于杂合基因型。光合利用效率性状与SNP标记的关联分析。利用SNaPshot技术对rubisco和Lhcb2基因的20个SNP位点进行了分型。采用ANOVA和GLM分析,对分型的SNP标记与光合特征及生长性状进行了关联分析。结果表明,共有4个SNP标记与光合特征及生长性状显著关联。其中SNP12、SNP36和SNP50位于rubisco基因内,SNP12和SNP36为非同义突变,分别导致天冬氨酸（Asn）-组氨酸（His）、酪氨酸（Tyr）-苯丙氨酸（Phe）间的变化;两标记均与ETR值显著关联,其AA基因型欧洲黑杨ETR值高于其它基因型;SNP50同时与Pn、ETR、Fv/Fm、树高和胸径显著关联,CT基因型欧洲黑杨具有较高的ETR值、Fv/Fm值、树高、胸径和较低的Pn值。Lhcb2基因的SNP44与树高性状显著关联,其GG基因型个体具有较大的树高生长量。

全文目录


摘要  5-7
ABSTRACT  7-13
第一章 绪论  13-40
  1.1 引言  13-15
    1.1.1 研究背景  13-14
    1.1.2 研究目的和意义  14-15
  1.2 国内外研究现状及评述  15-37
    1.2.1 杨树光合作用特征评价研究现状  15-18
    1.2.2 杨树水分利用及抗旱性评价研究现状  18-23
    1.2.3 杨树分子标记辅助育种研究现状  23-26
    1.2.4 单核苷酸多态性（SNP）技术  26-31
    1.2.5 SNP 在林木中的研究现状  31
    1.2.6 林木核苷酸多样性  31-32
    1.2.7 林木连锁不平衡  32-33
    1.2.8 林木关联遗传学  33-35
    1.2.9 林木进化与分子生态  35-37
  1.3 研究目标和主要研究内容  37-39
    1.3.1 关键的科学问题与研究目标  37-38
    1.3.2 主要研究内容  38-39
  1.4 研究技术路线  39-40
第二章 欧洲黑杨光合生理特征及生长评价  40-55
  2.1 材料与方法  40-45
    2.1.1 试验材料  40-44
    2.1.2 欧洲黑杨试验林的建立  44
    2.1.3 气体交换参数测定  44-45
    2.1.4 叶绿素荧光参数及生长测定  45
    2.1.5 数据分析  45
  2.2 结果与分析  45-53
    2.2.1 欧洲黑杨气体交换、叶绿素荧光与生长特征及其变异  45-46
    2.2.2 不同国家、区域间欧洲黑杨气体交换及叶绿素荧光特征的变异  46-50
    2.2.3 光合生理特征、生长性状及经纬度间的相关分析  50-52
    2.2.4 讨论  52-53
  2.3 小结  53-55
第三章 功能基因SNP 位点的筛选与分析  55-76
  3.1 材料与方法  55-63
    3.1.1 植物材料  55-57
    3.1.2 主要试剂、仪器设备及软件  57
    3.1.3 候选功能基因的选择与确定  57-58
    3.1.4 基因组DNA 的提取  58-59
    3.1.5 引物设计与目的基因的PCR 扩增  59-60
    3.1.6 PCR 产物的克隆与测序  60-61
    3.1.7 序列的编辑与SNP 位点的筛选  61-62
    3.1.8 核苷酸多样性分析  62
    3.1.9 选择中性检测和重组分析  62
    3.1.10 连锁不平衡分析  62-63
  3.2 结果与分析  63-71
    3.2.1 候选功能基因的序列分析  63-65
    3.2.2 SNP 位点的筛选  65
    3.2.3 核苷酸多样性  65-67
    3.2.4 进化的中性检测  67-69
    3.2.5 连锁不平衡与重组  69-71
  3.3 讨论  71-74
  3.4 小结  74-76
第四章 SNP 位点分型与关联分析  76-98
  4.1 材料与方法  76-81
    4.1.1 植物材料  76
    4.1.2 主要试剂、仪器设备与软件  76-77
    4.1.3 基因组DNA 的提取  77-78
    4.1.4 PCR 模板的制备  78
    4.1.5 对照反应的准备  78-79
    4.1.6 SNaPshot 引物设计  79-80
    4.1.7 SNP 位点的SNaPshot PCR 反应  80
    4.1.8 SNP 标记与水分、光合利用性状的关联分析  80-81
  4.2 结果与分析  81-92
    4.2.1 SNP 标记的分型及关联分析  81-82
    4.2.2 ERF 基因SNP2 与δ~(13)C 值的关联分析  82-84
    4.2.3 SuSY1 基因SNP15 与δ~(13)C 值的关联分析  84-85
    4.2.4 Expa1 基因4 个SNP 位点与δ~(13)C 值的关联分析  85-88
    4.2.5 Lhcb2 基因SNP44 与欧洲黑杨高生长的关联分析  88-89
    4.2.6 rubisco 基因3 个SNP 位点与光合及生长性状的关联分析  89-92
  4.3 讨论  92-96
  4.4 小结  96-98
第五章 结论与讨论  98-104
  5.1 结论  98-100
  5.2 讨论  100-102
  5.3 展望  102-104
参考文献  104-118
附录  118-120
在读期间的学术研究  120-121
致谢  121

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中图分类: > 农业科学 > 林业 > 森林树种 > 阔叶乔木 > 杨
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