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TAT介导的磁性纳米脂质体对脊髓损伤区域靶向分布的实验研究

作　者: 魏志坚
导　师: 冯世庆
学　校: 天津医科大学
专　业: 外科学
关键词: 脊髓损伤磁性纳米脂质体 TAT 雪旺细胞靶向性
分类号: R651.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

[目的]探讨一种FITC标记TAT介导的磁性纳米脂质体的制备和表征,在体外与雪旺细胞共培养的透膜能力；同时观察其在大鼠脊髓损伤后在脊髓组织局部聚集的情况,研究其对损伤大鼠脊髓分布的靶向性,为将来该脂质体介导药物治疗脊髓损伤确定提供实验依据。[材料与方法]本实验采用反相蒸发法制备兼具跨膜、长循环功能及包覆疏水性超顺磁性Fe304颗粒的TAT磁性纳米脂质体,透射电镜,粒径仪和Zeta电位仪测定脂质体粒径和基本表征。通过结扎Wistar成年大鼠单侧隐神经激活雪旺细胞,采用双酶消化组织块法结合机械分离法分离培养雪旺细胞；应用低浓度胶原酶、胰酶快速消化法和差速贴壁法纯化雪旺细胞。用S-100抗体、DAPI染色来鉴定雪旺细胞的纯度。将雪旺细胞分别与外接TAT磁性纳米脂质体及未接TAT磁性纳米脂质体共孵育,对照组加入未接TAT的磁性纳米脂质体(59μg/ml) 0.5ml:实验组加入外接TAT的磁性纳米脂质体(59μg/ml) 0.5ml,5%CO2,37℃共孵育1小时,在荧光显微镜下观察雪旺细胞对脂质体的摄取情况。本实验采用雌性Wistar大鼠16只,用IMPACTOR MODEL-Ⅱ打击器建立T10脊髓损伤(spinal cord injury, SCI))模型(10g×25mm)。造模成功后随机分为2组,分别于24小时通过尾静脉注射FITC标记的磁性纳米脂质体(1mg/kg),对照组注射未接TAT的磁性纳米脂质体,实验组加入外接TAT的磁性纳米脂质体注射后1小时处死大鼠,取出脊髓组织作5μm快速冰冻切片,在荧光显微镜下观察脂质体在脊髓组织中的聚集情况,同时取大鼠肝脏、脾脏、肾脏作冰冻切片并在荧光显微镜下观察脂质体被其它器官摄取情况。成年雌性Wistar大鼠16只,随机分为两组,对照组未作脊髓损伤处理,仅采取相同剂量进行麻醉,实验组建立脊髓损伤模型,两组动物均在尾静脉途径注射外接TAT的磁性纳米脂质体(1mg/kg),实验组时间点选取为伤后24小时,对照组为麻醉后24小时加制作模型所需时间。注射后1小时处死大鼠,取出脊髓组织作5μm快速冰冻切片,在荧光显微镜下观察脂质体在脊髓组织中的聚集情况。[结果]1.磁性脂质体呈球形,分散性较好,粒径较小,Zeta电位较高,外接TAT组与未接TAT组粒径及Zeta电位无明显差别。2.激活态雪旺细胞经分离、培养、纯化后,细胞生长旺盛。传至第4代时,低倍镜下几乎不见成纤维样细胞。雪旺细胞纯度达到95%以上。3.细胞摄取实验外接TAT的脂质体更多的聚集在雪旺细胞内部,并大多聚集在细胞核周围,而未接TAT的脂质体较少进入雪旺细胞,比较二者的镜下FITC荧光的平均光密度(average optical density, AOD),二者具有统计学差异。4.在荧光显微镜蓝色荧光激发下,FITC使磁性纳米脂质体呈现绿色荧光。在大鼠损伤脊髓组织中,外接TAT的脂质体更多的聚集在损伤脊髓周围,神经元细胞的胞浆中存在大量的荧光颗粒,聚集成片状显现出对核的趋向性,而未接TAT的脂质体则较少分布于受损脊髓。计算二者AOD值,结果具有统计学意义。5.在荧光显微镜蓝色荧光激发下,未接TAT组的肝、脾、肾脏中均可见明亮的绿色荧光,外接TAT组绿色荧光相对较弱。6.在荧光显微镜蓝色荧光激发下,正常大鼠脊髓组织中绿色荧光较少,而脊髓损伤大鼠的脊髓中聚集了大量的绿色荧光,计算二者AOD值,结果具有统计学意义。[结论]本研究证明了TAT介导的脂质体可大量进入受损脊髓,进入神经元细胞,并且具有靶向聚集受损脊髓组织的特性,为其成为装载治疗脊髓损伤药物的载体提供了可行性依据。

TAT介导的磁性纳米脂质体对脊髓损伤区域靶向分布的实验研究

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