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研究小分子与蛋白质作用的光谱集成分析技术

作　者: 张雅珩
导　师: 陈兴国
学　校: 兰州大学
专　业: 分析化学
关键词: 微乳液兰州大学蛋白质分子结合位点结合常数蛋白质相互作用岩白菜素有机小分子博士学位论文没食子酸
分类号: Q503
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

小分子与生物大分子相互作用的研究是化学生物学的重要研究内容。血清白蛋白是血浆中含量最丰富的重要载体蛋白,它能广泛地与许多内源性和外源性物质结合。IgG (γ-球蛋白)是生物体内最主要的免疫球蛋白分子之一,它在人类正常血清中含量最丰富。IgG具有超常的可逆结合药物、有机小分子和相关抗原的能力。研究小分子与血清白蛋白及免疫球蛋白的结合在药代动力学、毒理学上具有重要意义,已成为从事生命科学、化学和临床医学科研工作者共同关注的课题之一。本论文基于开展小分子与蛋白质相互作用的重要意义及国内外研究趋势,在前人工作的基础上,从以下几方面进行了创新性研究:(1)通过计算机分子模拟技术研究了染料小分子、中药活性组分与人γ-球蛋白(HGG)、人血清白蛋白(HSA)的作用模式,提出了小分子与蛋白质的相互作用的分子模型,为通过实验进一步研究二者相互作用提供了理论参考和重要信息;(2)综合利用光谱集成分析技术(荧光光谱、紫外-可见吸收光谱、傅里叶变换红外光谱(FT-IR )、圆二色谱(CD))研究了染料小分子、中药活性组分与HGG及HSA的相互作用,获得了准确一致的信息并验证了分子对接结果;(3)根据Scatchard方程、Sips方程和Van’t Hoff方程详细研究计算了中药活性组分、染料小分子与蛋白质的结合机理包括结合常数、结合位点数,推测了主要作用力类型;(4)利用数学方法(二阶导数,去卷积以及曲线拟合)对蛋白质红外光谱图进行解析,定量分析了不同小分子与HSA作用前后蛋白质二级结构的变化;(5)通过竞争实验,确定了小分子在HSA的结合位点,取得与分子对接基本一致的结果;(6)利用同步荧光光谱提供的信息,探讨了不同小分子-蛋白质体系中的蛋白质发色团微环境的改变;(7)研究了HSA在AOT/异辛烷/水的微乳介质中与中药活性组分的相互作用,为蛋白质与小分子的相互作用开拓了新的研究领域。论文共分为四章。第一章:简要介绍了蛋白质的结构功能,综述了研究小分子与蛋白质相互作用的各种方法的原理、应用情况及该领域的研究进展。第二章:应用计算机模拟技术和光谱集成分析技术对HGG与染料小分子中性红的相互作用进行了详细的研究。通过分子对接考察了中性红与HGG的作用模式,提出了二者相互作用的分子模型。利用Sips方法计算了中性红与HGG反应的平均亲和力常数和结合位点数,根据Van’t Hoff方程计算了反应的热力学参数,讨论了二者相互作用的主要作用力类型。利用FT-IR和CD考察了中性红对HGG二级结构的影响。第三章:首次利用分子模拟技术和光谱法详细研究了丹皮酚、柚皮苷分别与HSA和HGG的相互作用。通过分子对接确定这两种药物分别与HSA、HGG的结合区域和结合模式。光谱法研究结果表明,这两种药物与蛋白质之间可以发生结合作用,并猝灭蛋白质的荧光;利用荧光光谱法提供的信息计算了相互作用的结合常数、结合位点数、热力学参数;FT-IR及CD数据揭示了不同药物对两种蛋白质二级结构含量的影响程度。第四章:利用荧光光谱法、紫外-可见吸收光谱法、圆二色性光谱法、傅里叶变换红外光谱法和动态激光散射技术首次系统研究了在AOT/异辛烷/水构成的反相微乳介质中岩白菜素、秦皮甲素、没食子酸和咖啡酸与HSA之间的相互作用。分子对接从理论上分别研究了这四种药物与HSA的结合区域和结合模式。光谱数据表明,微乳液为HSA的氨基酸残基提供了非极性更强的微环境,发色团在微乳液中的活动性比起在水溶液中受到更大的限制;在微乳液中这些中药活性组分能够猝灭HSA的内源荧光,其结合常数随温度升高而降低。由热力学数据推测了在微乳液中药物分子与HSA之间的主要作用力类型。FT-IR和CD数据表明,药物与HSA的结合使其二级结构发生了变化。动态激光散射技术揭示了HSA在微乳液中的可能位置,并证明药物与HSA在微乳液中的相互作用。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-14
第一章有机小分子与蛋白质相互作用研究进展  14-74
  1.1 引言  14-15
  1.2 蛋白质分子的功能与结构基础  15-28
    1.2.1 蛋白质的生理功能  15-16
    1.2.2 蛋白质的结构  16-22
    1.2.3 维系和稳定蛋白质高级结构的因素  22-24
    1.2.4 血清白蛋白的结构和功能  24-25
    1.2.5 免疫球蛋白的结构和功能  25-28
  1.3 小分子与蛋白质相互作用的研究方法  28-60
    1.3.1 分子对接模拟技术  28-33
    1.3.2 紫外-可见吸收光谱法  33-34
    1.3.3 荧光光谱法  34-44
    1.3.4 圆二色性光谱法(CD)  44-46
    1.3.5 傅立叶变换红外光谱法(FT-IR)  46-49
    1.3.6 激光散射技术  49
    1.3.7 应用于小分子与蛋白质相互作用研究的其它方法  49-52
    1.3.8 小分子与蛋白质相互作用的研究实例  52-60
  1.4 微乳液中蛋白质与小分子相互作用的研究  60-61
  1.5 结论  61-63
  参考文献  63-74
第二章染料小分子中性红与人γ-球蛋白相互作用的研究  74-88
  2.1 引言  74-75
  2.2. 实验部分  75-76
    2.2.1 试剂和样品  75
    2.2.2 仪器和方法  75-76
  2.3. 结果与讨论  76-85
    2.3.1 中性红与人γ-球蛋白相互作用的分子模型研究  76-78
    2.3.2 中性红对人γ-球蛋白荧光猝灭作用的研究  78-79
    2.3.3 结合常数及结合位点数的计算  79-81
    2.3.4 键合模式的确定  81-83
    2.3.5 中性红引起人γ-球蛋白二级结构变化的研究  83-85
  2.4 结论  85-86
  参考文献  86-88
第三章丹皮酚、柚皮苷与人血清白蛋白、人γ-球蛋白的相互作用研究  88-121
  3.1 引言  88-89
  3.2. 实验部分  89-92
    3.2.1 试剂和样品  89-90
    3.2.2 仪器和方法  90-92
  3.3 结果与讨论  92-116
    3.3.1 丹皮酚和人血清白蛋白的相互作用研究  92-102
      3.3.1.1 丹皮酚与人血清白蛋白相互作用的分子模型研究  92-93
      3.3.1.2 丹皮酚对人血清白蛋白荧光猝灭作用的研究  93-95
      3.3.1.3 结合常数及结合位点数的计算  95-96
      3.3.1.4 键合模式的确定  96-97
      3.3.1.5 丹皮酚引起人血清白蛋白二级结构变化的研究  97-101
      3.3.1.6 丹皮酚在人血清白蛋白上结合位置的确定  101-102
    3.3.2 柚皮苷和人血清白蛋白的相互作用研究  102-110
      3.3.2.1 柚皮苷与人血清白蛋白相互作用的分子模型研究  102-103
      3.3.2.2 柚皮苷对人血清白蛋白荧光猝灭作用的研究  103-105
      3.3.2.3 结合常数及结合位点数的计算  105-106
      3.3.2.4 键合模式的确定  106-107
      3.3.2.5 柚皮苷引起人血清白蛋白二级结构变化的研究  107-109
      3.3.2.6 柚皮苷在人血清白蛋白上结合位置的确定  109-110
    3.3.3 柚皮苷和人γ-球蛋白的相互作用研究  110-116
      3.3.3.1 柚皮苷与人γ-球蛋白相互作用的分子模型研究  110-111
      3.3.3.2 柚皮苷对人γ-球蛋白荧光猝灭作用的研究  111-112
      3.3.3.3 结合常数及结合位点数的计算  112-113
      3.3.3.4 键合模式的确定  113-115
      3.3.3.5 柚皮苷引起人γ-球蛋白二级结构变化的研究  115-116
      3.3.3.6 人γ-球蛋白和人血清白蛋白与柚皮苷作用特性的比较  116
  3.4 结论  116-118
  参考文献  118-121
第四章某些中药活性组分与人血清白蛋白在AOT/异辛烷/水的微乳介质中的相互作用研究  121-169
  4.1 引言  121-122
  4.2 实验部分  122-125
    4.2.1 试剂和样品  122-123
    4.2.2 仪器和方法  123-125
  4.3. 结果与讨论  125-164
    4.3.1 人血清白蛋白的微乳体系的选择  125-126
    4.3.2 不同ω_0值微乳体系中人血清白蛋白的荧光光谱  126-127
    4.3.3 不同ω_0值微乳体系中人血清白蛋白的荧光各向异性  127
    4.3.4 不同ω_0值微乳体系中人血清白蛋白的紫外光谱  127-128
    4.3.5 岩白菜素与人血清白蛋白相互作用的微乳体系研究  128-137
      4.3.5.1 岩白菜素与人血清白蛋白相互作用的分子模型研究  128-129
      4.3.5.2 岩白菜素对人血清白蛋白的荧光猝灭作用的研究  129-131
      4.3.5.3 结合常数及结合位点数的计算  131-133
      4.3.5.4 键合模式的确定  133-134
      4.3.5.5 微乳液中岩白菜素引起人血清白蛋白二级结构变化的研究  134-136
      4.3.5.6 动态光散射研究微乳液中岩白菜素和人血清白蛋白的相互作用  136-137
    4.3.6 秦皮甲素与人血清白蛋白相互作用的微乳体系研究  137-145
      4.3.6.1 秦皮甲素与人血清白蛋白相互作用的分子模型研究  137-138
      4.3.6.2 秦皮甲素对人血清白蛋白的荧光猝灭作用的研究  138-139
      4.3.6.3 结合常数及结合位点数的计算  139-141
      4.3.6.4 键合模式的确定  141
      4.3.6.5 秦皮甲素在人血清白蛋白上结合位置的确定  141-142
      4.3.6.6 微乳液中秦皮甲素引起人血清白蛋白二级结构变化的研究  142-144
      4.3.6.7 动态光散射研究微乳液中秦皮甲素和人血清白蛋白的相互作用  144-145
    4.3.7 没食子酸与人血清白蛋白相互作用的微乳体系研究  145-154
      4.3.7.1 没食子酸与人血清白蛋白相互作用的分子模型研究  145-146
      4.3.7.2 没食子酸对人血清白蛋白的荧光猝灭作用的研究  146-148
      4.3.7.3 结合常数及结合位点数的计算  148-149
      4.3.7.4 键合模式的确定  149
      4.3.7.5 没食子酸在人血清白蛋白上结合位置的确定  149-150
      4.3.7.6 微乳液中没食子酸引起人血清白蛋白二级结构变化的研究  150-153
      4.3.7.7 动态光散射研究微乳液中没食子酸和人血清白蛋白的相互作用  153-154
    4.3.8 咖啡酸与人血清白蛋白相互作用的微乳体系研究  154-164
      4.3.8.1 咖啡酸与人血清白蛋白相互作用的分子模型研究  154-155
      4.3.8.2 咖啡酸对人血清白蛋白的荧光猝灭作用的研究  155-157
      4.3.8.3 结合常数及结合位点数的计算  157-158
      4.3.8.4 键合模式的确定  158-159
      4.3.8.5 咖啡酸在人血清白蛋白上结合位置的确定  159
      4.3.8.6 微乳液中咖啡酸引起人血清白蛋白二级结构变化的研究  159-163
      4.3.8.7 动态光散射研究微乳液中咖啡酸和人血清白蛋白的相互作用  163-164
  4.4 结论  164-165
  参考文献  165-169
攻读博士学位期间的研究成果  169-172
致谢  172

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