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小鼠ICSI新技术及其用于提高人类辅助生殖技术的研究

作　者: 曾明
导　师: 李思光；吕祁峰
学　校: 南昌大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 胞质内单精子注射(ICSI) 喇叭形固定针鼠卵成活率囊胚率跨物种间ICSI
分类号: R714.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

胞质内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)是20世纪80年代发展的一种新型辅助生殖技术,其实质就是用注射针携带单个精子直接注入到卵子胞浆内从而带到受精的目的。ICSI的建立为许多不孕不育夫妇带来了福音,目前已成为治疗男性不育的一种常规治疗手段。然而由于缺少合适的动物模型,阻碍了人类ICSI研究。小鼠卵子是一个非常理想化的ICSI动物模型,但因小鼠卵子体积较小、抗损伤能力弱等原因,小鼠ICSI研究进展缓慢。直到1995年Kimura等人将Piezo仪器用于小鼠卵ICSI,才获得了较高的鼠卵成活率、受精率及囊胚率。然而,由于Piezo-ICSI效果不稳定且存在潜在的汞污染而限制了其在临床及科研上的应用。本文是对一项新研发的ICSI技术(New-ICSI, N-ICSI)的应用和改进。N-ICSI的方法为：将固定针做成喇叭状的开口,先用固定针吸入部分透明带及胞质,然后直接用常规的尖口注射针插入卵胞质中,进行抽吸破膜并注射精子。现对实验结果归纳如下：①比较卵子行N-ICSI和C-ICSI的体外发育情况。实验表明,与常规的鼠卵注射方法(C-ICSI)相比,N-ICSI可以极其显著提高鼠卵ICSI后成活率(22% vs89%,P<0.01)。鼠卵行N-ICSI的正常受精率、卵裂率及桑椹胚率分别为85%、71%和61%,与C-ICSI差异不显著(88%、84%、76%,P>0.05)。N-ICSI和C-ICSI的囊胚率差异也不显著(65% vs 62%,P>0.05),但都显著低于激活组(97%,P<0.05)。优化和改善N-ICSI的实验条件,也许可以提高成囊率。②比较固定针开口内径及固定针吸入胞质长度这两个主要参数的不同组合对囊胚率的影响。结果发现当固定针为45μm的时候,卵子的成活率较低(64%)显著低于固定为50μm或55μm的卵成活率。而当吸入胞质长度为75μm时,成囊率(0%和33%)显著低于大部分其他组合,或者正常受精率极低(只有36%,其余为三倍体或多倍体)。而当固定针内径为55μm,胞质吸入长度为40μm时,卵子成活率、正常受精率、囊胚率。与内径为45μm吸长40μm相当,但内径为55μm的卵裂率明显低于内径为50μm的卵裂率。而当固定针内径为50μm,胞质吸入长度为40μm,可得到可观的成活率,正常受精率,卵裂率,桑椹胚率和囊胚率,故将该组参数视为最佳N-ICSI条件。③建立大批量小鼠卵子冷冻技术,每个载体可以装载20-50个卵子。将人精子注射(N-ICSI)到这些解冻复苏的小鼠卵子中并结合临床ICSI资料,可以判定部分临床ICSI过程失败的原因。④将N-ICSI最佳条件用于人精子注射鼠卵的跨物种ICSI,比较不同的人精子制动时间对鼠卵激活能力的影响。实验表明：用人精子对鼠卵行N-ICSI,可得到80%以上的成活率、90%以上的受精率和70%的卵裂率；并发现人精子在制动30min内激活鼠卵的能力没有发生变化。以上结果表明,本研究建立了一种高效、便捷、对鼠卵损伤较小的ICSI新方法。用人精对鼠卵行N-ICSI取得了很好的效果。然而,固定针吸入部分胞质的变形是否会对胚胎的后期发育有影响仍值得进一步研究。尽管如此,由于该方法的简单实用性,值得我们在临床及科研上尝试使用。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-9
第一章前言  9-20
  1.1 引言  9
  1.2 哺乳动物的正常受精  9-10
  1.3 ICSI的研究历史  10-11
  1.4 小鼠的ICSI研究  11-13
  1.5 ICSI的理论知识  13-16
    1.5.1 卵子的激活  13-14
    1.5.2 细胞骨架与中心粒  14-15
    1.5.3 精子顶体  15
    1.5.4 精子质膜的完整性及精子制动时间  15-16
  1.6 ICSI的应用  16-18
    1.6.1 ICSI广泛用于治疗男性不育  16-17
    1.6.2 ICSI用于治疗雄性小鼠不育  17
    1.6.3 ICSI用于转基因  17-18
  1.7 ICSI治疗的安全性  18
  1.8 本论文的研究目的和意义  18-20
第二章材料  20-22
  2.1 实验动物  20
  2.2 主要仪器设备  20-21
  2.3 试剂与耗材  21-22
第三章实验方法  22-32
  3.1 主要溶剂配制  22
  3.2 捡卵针及显微操作注射针、固定针的规格及制作  22-24
  3.3 促排卵和卵子的收集  24
  3.4 精子的准备  24
  3.5 ICSI前的准备  24-26
    3.5.1 ICSI操作盘的制作  24-25
    3.5.2 固定针、注射针的安装与精子的加入  25-26
  3.6 显微操作  26-28
  3.7 胚胎培养及观察  28-29
  3.8 大批量小鼠卵子玻璃化冷冻技术的建立及卵子的复苏  29-30
    3.8.1 大批量小鼠卵子玻璃化冷冻技术  29
    3.8.2 小鼠卵子的复苏  29-30
  3.9 实验设计  30-31
    3.9.1 N-ICSI和C-ICSI的效果比较  30
    3.9.2 不同固定针直径和不同的胞质变形程度对行N-ICSI后胚胎发育的影响  30
    3.9.3 结合临床和异种授精资料的人类精卵受精能力分析  30
    3.9.4 不同的精子制动时间对人精子激活鼠卵能力的影响  30-31
  4.0 数据分析  31-32
第四章结果与分析  32-40
  4.1 C-ICSI和N-ICSI的效果比较  32-35
  4.2 N-ICSI的最佳实验参数  35-37
  4.3 大批量小鼠卵子玻璃化冷冻技术的建立  37-38
  4.4 N-ICSI用于临床人精子激活能力的评估  38
  4.5 不同的精子制动时间对人精子激活鼠卵能力的影响  38-40
第五章结论与讨论  40-43
  5.1 结论  40
  5.2 讨论  40-43
致谢  43-44
参考文献  44-47
附录激活液配方  47-48
攻读学位期间的研究成果  48

小鼠ICSI新技术及其用于提高人类辅助生殖技术的研究

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