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HPV-16 L1腺病毒载体疫苗和鼠卵透明带3腺病毒载体疫苗免疫效果的研究

作　者: 陈开旭
导　师: 马正海
学　校: 新疆大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 重组腺病毒疫苗鼠卵透明带3 免疫不育人乳头状瘤病毒16型 L1
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

腺病毒载体是基因治疗中最为常用的一种载体,具有以下优点:安全性高,经人工改造的减毒腺病毒对人体无明显毒副作用;腺病毒DNA不会整合入宿主基因组,避免了对宿主基因的干扰;腺病毒可增强MHC分子和共刺激分子的表达,从而促进抗原递呈;腺病毒载体容量大,最大可容纳约37 kb的外源DNA;可高效感染哺乳动物细胞,能够获得高滴度的病毒。高危型人乳头瘤病毒(HPV)的持续感染是诱发宫颈癌的主要原因,其中以HPV-16和HPV-18最为常见。新疆南部维吾尔聚居区是我国宫颈癌高发区,该地区妇女宫颈癌的发病率高,发病年龄较其它民族低,其发生与HPV-16的感染密切相关。HPV主要衣壳蛋白L1结构保守,能够自组装形成病毒样颗粒,是宫颈癌预防性疫苗的理想靶抗原。哺乳动物卵透明带(zona pellucida, ZP)是由卵母细胞分泌并覆盖于卵母细胞外的一层糖蛋白基质,在种属特异性精卵识别、结合,诱导精子与透明带的结合、顶体反应、避免多精受精和胚胎植入前的保护等方面发挥着重要作用。ZP主要由3种糖蛋白(ZP1、ZP2和ZP3)组成,ZP3在受精过程中具有十分重要的作用,能够与精子专一性地结合并诱导精子的顶体反应。大量研究证实:抗ZP3抗体能够阻断精卵结合。因此,ZP3可作为免疫不育的理想靶抗原。本研究将携带新疆株人乳头状瘤病毒16型(HPV-16)主要衣壳蛋白L1基因和鼠卵透明带3 ( murine zona pellucida 3)基因的腺病毒重组DNA转染HEK 293A细胞,使其在HEK 293A细胞中进行包装;继而扩增重组腺病毒Adeno-mZP3和Adeno-L1,利用TCID50(半数组织培养感染剂量)法分别测定滴度, Adeno-L1滴度为:1.2×1010 PFU/mL,Adeno-mZP3滴度为:2.5×1011 PFU/mL, Adenovirus滴度为:2.4×1011 PFU/mL。将获得的重组腺病毒Adeno-mZP3和Adeno-L1分别以滴鼻和灌胃两种途径免疫BALB/c小鼠。实验组每只小鼠接种1×108 PFU重组腺病毒,对照组每只小鼠接种1×108 PFU野生型腺病毒,每隔两周免疫1次,免疫3次,免疫后第14天、第28天和第28天采集小鼠血清,ELISA法检测重组腺病毒诱导的体液免疫反应,并比较两种免疫途径诱导免疫反应的差异。接种重组腺病毒Adeno-mZP3的雌性小鼠在第3次免疫后7天与已验证有生殖能力的雄鼠合笼,观察雌鼠受孕情况,判断重组腺病毒Adeno-mZP3所诱导的小鼠免疫不育效果。免疫检测结果显示:重组腺病毒Adeno-mZP3和Adeno-L1通过滴鼻和灌胃免疫小鼠后第14d、第28d、第42d,小鼠血清中相应抗体水平均比对照组小鼠高,二者存在极显著性差异(P<0.001);说明2种重组腺病毒通过滴鼻和灌胃免疫小鼠均能激发较强的体液免疫反应,且在3次免疫后,滴鼻免疫组小鼠血清中抗体水平高于灌胃免疫组。重组腺病毒Adeno-mZP3免疫组合笼实验的结果表明,滴鼻免疫小鼠的生育率和平均窝崽数均低于对照组,实验组与对照组的平均窝崽数存在显著性差异(P=0.021<0.05);灌胃免疫小鼠的生育率和平均窝崽数与对照组相比没有明显降低,实验组与对照组的平均窝崽数差异不显著(P=0.102>0.05)。以上结果说明腺病毒载体疫苗滴鼻免疫能诱导产生较好的免疫效果。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-12
英文缩写  12-13
第一部分文献综述  13-25
  腺病毒载体的研究进展  13-25
    1. 腺病毒的生物学特征  13-14
    2. 腺病毒感染机制  14-15
    3. 腺病毒载体的发展过程  15-16
    4. 腺病毒载体在基因治疗中的应用  16-17
    5. 腺病毒载体在疫苗研究中的应用  17-18
    6. 重组腺病毒载体介导的抗肿瘤基因治疗  18-20
      6.1 腺病毒介导的肿瘤抑制基因治疗  18-19
      6.2 腺病毒介导的相关细胞因子免疫治疗  19
      6.3 腺病毒介导的抑制肿瘤血管生成基因治疗  19
      6.4 腺病毒介导的基因替代结合放化疗的基因治疗  19
      6.5 应用复制型腺病毒载体的治疗  19-20
    7. 展望  20
    参考文献  20-25
第二部分实验部分  25-64
  第一章 HPV-16 L1 腺病毒载体疫苗免疫效果的研究  25-45
    1 材料  29
      1.1 病毒和细胞  29
      1.2 主要试剂  29
      1.3 实验动物  29
    2 方法  29-33
      2.1 重组腺病毒质粒 DNA Adeno-L1 的鉴定  29-30
      2.2 重组腺病毒Adeno-L1 在HEK 293A 细胞中的包装  30
      2.3 PCR 鉴定重组腺病毒Adeno-L1  30-31
      2.4 腺病毒Adeno-L1 的大量扩增和浓缩  31
      2.5 腺病毒 Adeno-L1 的滴度测定  31-32
      2.6 Adeno-L1 感染细胞中 L1 蛋白的检测  32
      2.7 动物免疫  32-33
      2.8 ELISA 检测免疫后小鼠的抗体水平  33
      2.9 统计学分析  33
    3 结果  33-37
      3.1 重组腺病毒质粒 Adeno-L1 的鉴定  33-34
      3.2 重组腺病毒感染引起的细胞病变  34
      3.3 重组腺病毒 Adeno-L1 的 PCR 鉴定  34-35
      3.4 Adeno-L1 感染细胞中 L1 蛋白的检测  35-36
      3.5 免疫小鼠血清中L1 抗体效价的检测  36-37
    4. 讨论  37-40
    5. 参考文献  40-45
  第二章鼠卵透明带3 基因重组腺病毒载体诱导小鼠免疫不育效果的研究  45-64
    1 材料  49
      1.1 病毒和细胞  49
      1.2 主要试剂  49
      1.3 实验动物  49
    2 方法  49-51
      2.1 重组腺病毒质粒DNA Adeno-mZP3 的鉴定  49
      2.2 重组腺病毒Adeno-m ZP3 在HEK 293A 细胞中的包装  49
      2.3 PCR 鉴定重组腺病毒Adeno-m ZP3  49-50
      2.4 Adeno-m ZP3 感染细胞中mZP3 蛋白的检测  50
      2.5 腺病毒Adeno-mZP3 的大量扩增和浓缩  50
      2.6 腺病毒Adeno-mZP3 的滴度测定  50
      2.7 动物免疫  50-51
      2.8 ELISA 检测免疫后小鼠的抗体水平  51
      2.9 小鼠合笼  51
      2.10 统计学分析  51
    3 结果  51-57
      3.1 重组腺病毒质粒 Adeno-mZP3 的鉴定  51-52
      3.2 重组腺病毒感染引起的细胞病变  52-53
      3.3 重组腺病毒Adeno-mZP3 的PCR 鉴定  53
      3.4 Adeno-mZP3 感染细胞中mZP3 蛋白的检测  53-54
      3.5 免疫小鼠血清中mZP3 抗体水平的检测  54-56
      3.6 不同途径免疫小鼠的生育率  56-57
    4. 讨论  57-59
    5. 参考文献  59-64
第三部分结论  64-65
第四部分附录  65-72
  附录1 重组腺病毒 Adeno-L1 免疫小鼠后ELISA 检测结果  65-68
  附录2 重组腺病毒 Adeno- m ZP3 免疫小鼠后ELISA 检测结果  68-71
  附录3 致谢  71-72
  附录4 个人简历  72

HPV-16 L1腺病毒载体疫苗和鼠卵透明带3腺病毒载体疫苗免疫效果的研究

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