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肝细胞癌中自体吞噬增强的相关研究

作　者: 王昊
导　师: 胡和平
学　校: 第二军医大学
专　业: 内科学
关键词: 自体吞噬肝细胞癌电镜 Beclin-1
分类号: R735.7
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

一、研究背景和目的肝细胞肝癌(HCC)是中国南部、台湾、东南亚以及非洲撒哈拉地区最常见的恶性肿瘤之一。尽管诊断和治疗方法在进步,但HCC患者的总生存率依然很低。实际上HCC是一种对传统抗癌药高度耐药的肿瘤。众所周知凋亡的缺失是肿瘤细胞的标志之一,抗肿瘤治疗不能引发凋亡导致了化疗的失败和肿瘤的进展。然而在肿瘤,特别是在进行性肿瘤中,自体吞噬的作用,一种半胱天冬酶依赖的细胞死亡程序和其潜在的分子机制是相互矛盾的。细胞自体吞噬是多余的或不健全的细胞成份的降解。它的发生是细胞日常活动的一部分,也是对诸如饥饿之类的压力刺激的一种反应。自体吞噬主要分为3种类型:巨型自体吞噬、微型自体吞噬和分子伴侣介导的自体吞噬,一般情况下自体吞噬均指巨型自体吞噬。自体吞噬过程中有多种基因参与,目前Beclin-1研究的较为深入。Beclin-1在人类卵巢癌、乳腺癌和前列腺癌中是单等位缺失的。据报道75%卵巢癌、50%乳癌以及40%前列腺癌中存在Beclin 1基因的缺失性突变。MAP-LC3是另一种参与自体吞噬的小蛋白质,研究比较详尽。MAP-LC3的脂质修饰形式位于自体吞噬体的内膜和外膜,其与荧光蛋白形成融合蛋白后,很容易在细胞内定位,所以MAP-LC3通常被用作哺乳动物细胞中自体吞噬膜的标记蛋白。在肝癌细胞中,关于自体吞噬情况和Beclin 1表达的研究尚无定论。有学者认为也是下调的,下调程度可能和肿瘤恶性度和分型相关。本院长期收集的肝癌活检标本,并留有电镜照片,经我们收集整理相关照片,发现肝癌组织中自体吞噬现象增强。本课题通过大量患者组织标本的电镜观察及实验室检测,结合细胞水平研究探讨肝癌中自体吞噬现象增强的原因。为自体吞噬及其相关基因在肝癌发生及进展过程中的作用和临床意义提供新的证据。二、材料和方法收集2006-2007年间第二军医大学附属东方肝胆外科医院的手术切除肝细胞癌标本54例,平均年龄50.2(17～70)岁,患者术前未经任何抗癌治疗,每例标本均包括肝癌组织及距肿瘤边缘>2 cm的癌旁组织,标本经分装后将用于免疫组化检测的样本行甲醛固定,Western Blot检测的标本行液氮保存,所有病例均经临床和病理检查明确诊断。应用电镜方法检测自体吞噬在组织中的表达及分布,进一步用Western blot及免疫组化验证其相关蛋白在肝癌及癌旁组织中的差异表达;结合细胞水平研究探讨肝癌细胞中自体吞噬现象高表达的原因,并应用SPSS统计软件对相关检测结果结合临床资料进行统计分析。三、结果1.组织水平观察自体吞噬并检测相关蛋白表达:a.电镜观察结果:肝细胞癌肿瘤细胞内自体吞噬现象极为普遍,但在胆管细胞癌肿瘤细胞内和癌旁细胞内极少有自体吞噬现象。b. Western blot结果:大部分肝细胞癌肿瘤组织中Beclin-1的表达情况明显高于癌旁组织中Beclin-1的表达情况,总体来看,约有一半肿瘤组织内Beclin-1高表达;肿瘤组织中Beclin-1的表达情况和电镜观察到肿瘤组织内自体吞噬的情况相吻合,c.免疫组化检查LC3蛋白表达的结果:肝肿瘤组织中的LC3蛋白的表达情况特异性不强,多数肝细胞癌组织中表达LC3蛋白。2.细胞水平研究自体吞噬增强的原因:a.当pcDNA3-Flag-HBx质粒转染正常肝细胞及肝癌细胞株后,HBX蛋白的表达会伴随细胞内Beclin-1的表达上调,且Beclin-1表达多少与HBX蛋白表达的多少呈正相关;b.当pcDNA3-Flag-HBx质粒转染正常肝细胞及肝癌细胞株后,HBX蛋白的表达会伴随细胞线粒体膜通光度的下降和粘度的增加,说明线粒体水肿程度在增加,线粒体膜的流动性在减弱,线粒体的损伤在加重,且线粒体损伤的程度和HBX蛋白的表达呈正相关;c.通过电镜观察,转染过cDNA3-Flag-HBx质粒的细胞在饥饿环境下,细胞内自体吞噬现象明显加强。3.肝癌组织超微结构的相关分析:a.肝细胞癌细胞内的线粒体的数量和大小较癌旁肝细胞内有明显改变,表现为数量的减少和体积的缩小;所有HBV感染的肝细胞和肝癌细胞线粒体均出现不同程度的肿胀,髓样结构模糊,甚至空泡化;但胆管细胞癌细胞内线粒体结构相对完好。b.溶酶体在癌旁细胞内大量出现,常伴有吞噬现象,可能是微型自体吞噬,而肝细胞癌细胞内很少出现。c.肝细胞癌细胞内粗面内质网普遍大量增生,且出现粗面内质网包绕线粒体并消化的现象,说明自体吞噬体膜来源除光面内质网,高尔基体,还有可能来自于粗面内质网。4.自体吞噬相关蛋白表达结合患者临床资料的相关分析:a.肿瘤组织中LC3表达较低的患者容易出现腹痛,腹胀等临床症状,血总胆红素和ALT、r-GT也相对较高,可能说明肿瘤组织中LC3含量越低,患者症状越重。b.在肿瘤组织中Beclin-1高表达情况下,患者出现临床症状如腹痛的可能性相对较低;c.肿瘤组织和癌旁组织Beclin-1表达差异不明显情况下,肿瘤体积相对更大。d.多数资料无统计学意义,须扩大样本量。四、结论:自体吞噬现象在肝癌是明显的,其相关蛋白Beclin-1在肝癌中表达也是上调的,而在癌旁组织中以及胆管癌中,这些现象却不明显;HBX蛋白能增加细胞内Beclin-1的表达,也能损伤细胞内的线粒体。自体吞噬增加的原因可能包括:a.HBX能直接引起自体吞噬;b.肝癌组织中明显的自体吞噬现象可能与因HBV感染受损的线粒体在应激状态下被清除有关;癌旁组织细胞内出现的大量溶酶体可能是微型自体吞噬,可能与肝癌细胞的侵蚀作用相关;粗面内质网可能参与自体吞噬体膜d的构成;自体吞噬功能可能与肿瘤的大小以及病情相关,须扩大样本量进一步研究。

全文目录

摘要  6-9
Abstract  9-13
前言  13-16
第一部分组织水平观察自体吞噬并检测相关蛋白表达  16-48
  试剂和仪器  16-20
    1. 主要化学药品和生物试剂  16
    2. 主要溶液的配制（主要参照分子实验克隆指南，第二版）  16-18
    3. 主要仪器  18-19
    4. 组织来源  19-20
  实验方法  20-24
    1. 肝癌电镜标本的制备方法  20
    2. 组织总蛋白提取和浓度测定  20
    3. Western blot 操作步骤  20-21
    4. 免疫组织化学方法  21-23
    5. 免疫组化结果判定方法  23
    6. 数据统计  23-24
  实验结果  24-46
    1. 肝癌及癌旁肝组织中的自体吞噬表达情况  24-43
      1.1 电镜下肝癌及癌旁肝组织超微结构的照片及观察描述  24-42
      1.2 细胞内自体吞噬体超微结构观察的结论  42-43
    2. western blot 检测肝癌及癌旁样本中Beclin-1 的表达情况  43-45
    3. 组织细胞内自体吞噬情况与Beclin-1 表达的相关性分析  45
    4. 组织细胞内LC3 蛋白达情况  45-46
  结论  46-48
第二部分细胞水平研究自体吞噬增高的原因  48-55
  试剂和仪器  48
  实验方法  48-50
  实验结果  50-54
    1. 细胞转染质粒pcDNA3-Flag-HBx后蛋白的表达情况  50-51
    2. 细胞线粒体肿胀度测定  51-52
    3. 线粒体膜流动性测定  52-53
    4. 细胞转染后的超微结构观察  53-54
  结论  54-55
第三部分肝癌组织超微结构的相关分析  55-58
  1. 肝癌细胞及癌旁肝组织超微结构特征的统计分析  55-57
  2. 结论  57-58
第四部分结合自体吞噬相关蛋白表达结果分析患者临床资料  58-91
  1. 肝癌组织中Beclin-1 的表达情况与患者临床资料的分析比较  58-73
    1.1 Western Blot 检测结果和临床资料统计分析的结论  71-73
  2. 肝癌及癌旁样本中LC-3 表达的临床意义  73-87
    2.1 免疫组化法检测LC3 表达的结论  87
  3. 临床特征对肿瘤内Beclin-1 和LC3 表达相关性分析  87-89
  4. 结论  89-91
讨论  91-94
参考文献  94-98
附录一文献综述  98-106
致谢  106

肝细胞癌中自体吞噬增强的相关研究

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