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胡枝子传粉生物学及分子标记应用的研究

作　者: 骈瑞琪
导　师: 陈晓阳
学　校: 北京林业大学
专　业: 林木遗传育种
关键词: 二色胡枝子传粉生物 SSR标记 SRAP标记 ITS trnL-F
分类号: S541.5
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

胡枝子属(Lespedeza Michx)植物是我国重要的生态经济型灌木树种,该属植物具有分布广泛,适应性强,产品用途广等特点,近年来对其开发利用逐渐受到重视。但同国外相比,我国对胡枝子属的开发利用还处于较低的水平。为了更好地开展遗传改良工作,有必要对胡枝子属植物的遗传背景和亲缘关系等生物学特性进行深入系统的研究。本研究以二色胡枝子的24个种源和10种胡枝子为研究材料,围绕二色胡枝子群体遗传结构和部分胡枝子属植物种间系统发育两个问题,采用传粉生物学、分子标记和DNA测序等技术手段,开展了二色胡枝子种群遗传多样性和胡枝子种间部分个体的系统发育研究。此外,还首次开发出胡枝子属物种特异性SSR引物。通过以上研究,得到以下主要结论:1.开展了花粉活力、柱头可授性和繁育系统研究。筛选出适于二色胡枝子花粉培养的液体培养基,并找到快速测定其花粉活力的染色法。对比不同贮藏条件下花粉活力变化发现,4℃干燥条件下花粉活力可维持一周。通过采用杂交指数(OCI)、花粉-胚珠比(P/O)、去雄—套袋—人工授粉试验检测到二色胡枝子的繁育系统属于部分自交亲和,异交且需要传粉者的类型。二色胡枝子属于虫媒传粉,高频率昆虫访花可明显提高二色胡枝子的结实率。2.建立并优化了二色胡枝子SRAP反应体系,并对二色胡枝子种源开展遗传多样性研究。筛选出17对SRAP引物组合,对24个种源材料进行了遗传多样性分析,共扩增出464条带,多态性位点百分率为87.28%。种源水平上,每位点的平均等位基因数1.881,平均有效等位基因数1.568,Nei’s基因多样性指数为0.331,Shannon信息指数为0.491。种源间遗传距离变幅为0.1029～0.3434,种源间遗传一致度范围为0.709～0.902。种源间的遗传分化系数Gst为0.4157,这表明58.4%的遗传多样性存在于二色胡枝子种源内。种源间基因流Nm为0.7028。基于Nei’s遗传距离的聚类结果,二色胡枝子24个种源可以分为五大类。同时应用SRAP标记对10种胡枝子进行了亲缘关系研究,以遗传距离0.52为阀值,可以将10种胡枝子分为三大类,阴山胡枝子和牛枝子首先聚为一类,截叶胡枝子、绒毛胡枝子和多花胡枝子聚到一起,其余的五种胡枝子聚为一类。这一聚类结果并不完全符合传统形态学上的分类情况。3.结合ISSR和染色体步移技术开发出SSR引物。依据ISSR引物扩增测序结果设计出6对巢式PCR引物,结合巢式PCR结果共开发出20对SSR引物,其中10对可用于胡枝子属内不同种间的转移扩增。同时应用所开发的SSR引物对10种胡枝子的亲缘关系进行了研究,结果表明,10种胡枝子可分为三大类,第一类包括截叶胡枝子和绒毛胡枝子,阴山胡枝子和牛枝子先聚到一起,然后再与多花胡枝子聚为一类,其余的五种胡枝子聚为一类。表明多花胡枝子与阴山胡枝子,以及牛枝子的亲缘关系相对较近。4.依据测序结果构建了胡枝子属部分种的系统发育树。测序得到了9种胡枝子的ITS序列和10种胡枝子的叶绿体trnL-F序列,同时结合GenBank上近缘物种的相关序列开展胡枝子属系统发育研究。序列分析结果表明,ITS序列中包含61个信息位点,占比对长度的10%,相比之下,trnL-F序列中仅有不到1%的信息位点。对两个片段分别采用MP和NJ法构建了系统发育树,结果表明,对单个片段而言,基于不同方法构建的系统发育树大体上一致,仅是在自展支持率上略有不同,并且NJ树中小支的关系比MP树清楚。对比两个片段构建的系统发育树,显示二者的拓扑结构大体相似,但是多花胡枝子的聚类位置明显有不同。在基于ITS序列的系统发育树中,多花胡枝子和大胡枝子组的物种聚到一起,而在基于tmL-F序列的系统发育树中,它又独立于大胡枝子组和胡枝子组外,单独为一支。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-9
本文缩略词(Abbreviation)  9-10
目录  10-14
1 引言  14-32
  1.1 传粉生物学与繁育系统研究进展  15-17
    1.1.1 传粉生物学研究进展  15-16
    1.1.2 繁育系统研究  16-17
  1.2 遗传多样性研究  17-23
    1.2.1 相关序列扩增多态性SRAP分子标记  18-20
    1.2.2 SSR标记技术  20-23
  1.3 植物分子系统学研究  23-27
    1.3.1 叶绿体基因组  23-25
    1.3.2 核基因组  25-26
    1.3.3 线粒体DNA  26-27
  1.4 胡枝子属遗传育种研究进展  27-29
    1.4.1 遗传资源研究  27-28
    1.4.2 开花繁殖生物学  28-29
    1.4.3 杂交育种  29
  1.5 研究内容和技术路线  29-32
2 二色胡枝子传粉生物学研究  32-52
  2.1 材料与方法  32-36
    2.1.1 实验地概况和材料  32-33
    2.1.2 花粉培养基的筛选  33
    2.1.3 花粉生活力测定的染色方法筛选  33-34
    2.1.4 花粉贮藏试验  34
    2.1.5 花器大小测量及开花动态的观察  34
    2.1.6 花粉活力及柱头的可授性日变化  34-35
    2.1.7 花粉-胚珠比(P/O)的测定  35
    2.1.8 繁育系统研究  35
    2.1.9 访花昆虫行为  35-36
    2.1.10 统计分析  36
  2.2 结果与分析  36-47
    2.2.1 蔗糖、硼、钙、镁和钾单因子对花粉萌发的影响  36-37
    2.2.2 蔗糖、硼酸两因子正交试验  37-38
    2.2.3 各种染色方法的比较  38-39
    2.2.4 不同贮藏条件下花粉活力的变化情况  39-40
    2.2.5 开花动态及花部形态测定  40-42
    2.2.6 花药开裂及花粉活力日变化  42-44
    2.2.7 柱头可受性测定结果  44-45
    2.2.8 繁育系统研究  45-46
    2.2.9 昆虫访花行为及频率变化  46-47
  2.3 讨论  47-50
    2.3.1 种群开花和单花开放的研究结果  47-48
    2.3.2 花部特征与传粉者的关系  48
    2.3.3 二色胡枝子的花粉活力与柱头可受性  48-49
    2.3.4 二色胡枝子的繁育类型  49-50
    2.3.5 访花昆虫对结实率的影响  50
  2.4 小结  50-52
3 SRAP标记在胡枝子属植物中的应用  52-72
  3.1 材料与方法  52-56
    3.1.1 试验材料  52-53
    3.1.2 DNA提取与检测  53-54
    3.1.3 SRAP反应体系的建立和优化  54-56
  3.2 结果与分析  56-70
    3.2.1 胡枝子DNA提取及检测  56-57
    3.2.2 SRAP反应体系的建立与优化  57-60
    3.2.3 SRAP引物的筛选及多态性分析  60-61
    3.2.4 二色胡枝子群体遗传变异的POPGENE分析  61-65
    3.2.5 二色胡枝子群体遗传变异的AMOVA分析  65
    3.2.6 二色胡枝子种源间的遗传距离和聚类分析  65-68
    3.2.7 胡枝子种间亲缘关系的SRAP分析  68-70
  3.3 讨论  70-71
    3.3.1 SRAP标记在胡枝子属研究中的适用性  70
    3.3.2 SRAP引物的分析  70
    3.3.3 基于SRAP标记的二色胡枝子遗传多样性分析  70-71
  3.4 小结  71-72
4 胡枝子属植物SSR引物的开发和应用  72-86
  4.1 材料与方法  72-78
    4.1.1 试验材料  72
    4.1.2 胡枝子基因组DNA提取与检测  72-73
    4.1.3 ISSR扩增和克隆测序  73-75
    4.1.4 染色体步移  75-78
  4.2 结果与分析  78-83
    4.2.1 胡枝子DNA的提取和检测  78
    4.2.2 ISSR片段扩增和克隆测序  78-79
    4.2.3 DNA酶切片段文库分析  79
    4.2.4 巢式PCR扩增结果分析  79-80
    4.2.5 巢式PCR产物的回收和菌落PCR检测  80
    4.2.6 巢式PCR第一轮引物的设计  80-81
    4.2.7 巢式PCR第二轮产物测序和SSR引物的设计  81
    4.2.8 SSR引物的初步应用  81-83
  4.3 讨论  83-85
    4.3.1 用于DNA提取的材料  83-84
    4.3.2 ISSR和染色体步移相结合方法开发SSR引物的评价  84-85
    4.3.3 引物的有效性  85
  4.4 小结  85-86
5 胡枝子属种间亲缘关系的研究  86-100
  5.1 材料与方法  87-90
    5.1.1 试验材料  87
    5.1.2 试验方法  87-89
    5.1.3 数据分析  89-90
  5.2 结果与分析  90-97
    5.2.1 DNA提取结果  90
    5.2.2 ITS序列的扩增、纯化和测序  90
    5.2.3 trnL-F序列的扩增、测序  90-91
    5.2.4 序列分析  91-92
    5.2.5 序列间进化距离分析  92-93
    5.2.6 系统发育树的构建和比较  93-97
  5.3 讨论  97-99
    5.3.1 ITS序列的分析  97-98
    5.3.2 trnL-F序列的分析  98
    5.3.3 建树方法的比较  98-99
  5.4 小结  99-100
6 全文讨论和结论  100-108
  6.1 全文讨论  100-104
    6.1.1 二色胡枝子的繁育系统  100
    6.1.2 二色胡枝子的遗传多样性分析  100-102
    6.1.3 胡枝子种间亲缘关系的分析  102-104
  6.2 结论  104-105
  6.3 下一步研究的建议  105-108
参考文献  108-122
个人简介  122-124
获得成果目录清单  124-126
导师简介  126-128
致谢  128-129

胡枝子传粉生物学及分子标记应用的研究

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