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盐地碱蓬膜相关蛋白及其在耐盐中的作用

作　者: 陈敏
导　师: 王宝山
学　校: 山东师范大学
专　业: 植物学
关键词: 盐地碱蓬液泡膜Na~+/H~+ antiporter Na~+区隔化质膜H~+-ATPase Na~+的外排质膜水孔蛋白叶片肉质化
分类号: Q945.78
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

高盐造成的渗透胁迫、离子胁迫严重干扰植物体内业已存在的细胞及整株水平上的水分及离子稳态,造成植物细胞分子损伤、生长减缓,甚至死亡。因而植物对抗盐胁迫的一个重要策略是在高盐环境下重建体内的稳态(homeostasis),包括重建离子稳态(ionic homeostasis)和渗透稳态(osmotic homeostasis)。黎科植物盐地碱蓬是一种生长在盐渍土壤中的C3植物,主要分布在中国北部的高盐地区,其叶片上没有盐腺和盐囊泡。初步研究表明100-400 mmol/L NaCl处理增加了盐地碱蓬的鲜重、干重;增加了其体内的离子含量;增加了其肉质化程度。也就是说100-400 mmol/L NaCl处理不但没有抑制其生长,反而促进了盐地碱蓬的生长。众所周知无论是盐生植物还是非盐生植物,其细胞质中的酶和许多重要的代谢过程对Na~+都非常敏感。NaCl (100-400 mmol/L)处理大大增加了盐地碱蓬体内的离子(主要是Na~+)含量,但盐地碱蓬的生长却受到促进,说明盐处理条件下盐地碱蓬的细胞质中并没有积累过多的Na~+,外界高浓度的Na~+肯定会使Na~+顺浓度梯度进入细胞,进入细胞的Na~+可能主要有两个去向,一是液泡,因为在成熟的植物细胞中液泡占到细胞总体积的约90%,所以液泡是Na~+的主要去向;另一个就是将Na~+排出细胞外。即细胞质内的Na~+通过液泡膜和质膜这两个层面得以降低。Na~+进入细胞后降低了细胞的水势,有利于细胞从高盐环境中吸收水分,吸收水分一方面维持了细胞的膨压有利于细胞生长,另一方面也能稀释进入植物体内的Na~+,所以盐渍条件下盐生植物能否充足的吸收水分也是其耐盐性的一个重要策略。本实验以典型的积盐型盐生植物盐地碱蓬为材料,分析了液泡膜上的相关蛋白在Na~+区隔化入液泡中的作用;质膜上的相关蛋白对Na~+外排的作用;质膜水孔蛋白在盐地碱蓬吸收水分中的作用,主要实验结果如下:1.盐地碱蓬液泡膜H~+-ATPase和Na~+/H~+ antiporter在Na~+区隔化中起重要作用我们以盐地碱蓬幼苗为材料,在整株水平上研究了盐地碱蓬适应高盐的策略,结果表明:第一,对于盐地碱蓬来说,Na~+是一个有益的元素, 100-400 mmol/L的NaCl处理增加了盐地碱蓬幼苗的生物量;第二,盐渍条件下,盐地碱蓬积累Na~+的能力很强,盐处理后它所吸收的Na~+总量的94%积累在地上部分,尤其是在叶片中,而叶片中的Na~+总量的98%积累在叶片共质体中;第三,和对照相比盐处理增加了盐地碱蓬叶片液泡膜V-H~+-ATPase水解活性、V-H~+-ATPase质子泵活性和Na~+/H~+ antiporter活性。并且表明Na~+/H~+ antiporter活性的增加是由于此基因转录和翻译的增加所致。液泡膜V-H~+-ATPase和Na~+/H~+ antiporter活性的增加在盐地碱蓬Na~+区隔化入液泡中起重要作用。2.盐地碱蓬愈伤组织通过调节质膜H~+-ATPase适应盐渍环境质膜H~+-ATPase所建立的跨质膜电化学势梯度是细胞与环境之间进行物质交换的主要驱动力。本实验用不同浓度的NaCl处理盐地碱蓬愈伤组织,来研究盐地碱蓬在细胞水平上的耐盐情况。分别用0、50、150、250 mmol/L NaCl处理愈伤组织7 d,结果表明50 mmol/L NaCl是愈伤组织生长的最适NaCl浓度,此时其相对生长速率达到最大值,有机干重明显高于对照(P < 0.05),但其含水量和对照相比没有显著变化;随着NaCl浓度的增加,各种无机离子(Ca2~+除外)和有机溶质的浓度都明显增加,其中增加最多的是Na~+。在0-150 mmol/L NaCl浓度范围内,盐地碱蓬愈伤组织质膜H~+-ATPase的水解活性逐渐增大,NaCl浓度为250 mmol/L时,质膜H~+-ATPase的水解活性显著降低。用50 mmol/L NaCl处理愈伤组织时,愈伤组织的质子分泌速率达到最大值,而NaCl浓度为150 mmol/L时,其质子分泌速率与对照相比没有明显差别,但NaCl浓度为250 mmol/L时,愈伤组织的质子分泌速率却显著下降。Northern blot分析表明50 mmol/L NaCl处理增加了愈伤组织PMH~+-ATPase基因的表达,处理2天(48小时)时表达量达到最大,随盐胁迫时间的延长,盐地碱蓬愈伤组织PM H~+-ATPase基因表达量逐渐降低,但仍明显高于对照。利用质膜PM H~+-ATPase单克隆抗体46E5B11D5对盐地碱蓬愈伤组织PM H~+-ATPase质膜微囊进行Western blot分析发现:盐胁迫明显诱导了盐地碱蓬愈伤组织PM H~+-ATPase蛋白的表达,当NaCl浓度为150 mmol/L时,蛋白量达到最大值。这些结果表明:盐地碱蓬愈伤组织细胞通过在基因、蛋白及活性等不同水平上调节质膜H~+-ATPase适应盐渍环境。3.水孔蛋白在盐渍条件下对盐地碱蓬叶片的肉质化起重要作用质膜水孔蛋白决定植物细胞的水分状况。用100 mmol/L NaCl处理盐地碱蓬幼苗10 d后测定了盐地碱蓬幼苗叶片肉质化程度、叶片原生质体的水通透性、叶片质膜水孔蛋白的表达情况。结果表明:盐处理条件下,盐地碱蓬叶片的肉质化程度与叶片细胞原生质体的水通透性成正相关,都显著增加;NaCl处理增加了质膜水孔蛋白的转录和翻译。所以我们认为盐处理条件下,质膜水孔蛋白活性的增加是由于其转录和翻译上调的结果,这与盐地碱蓬叶片的肉质化程度的增加一致,说明水孔蛋白在盐渍条件下对盐地碱蓬叶片的肉质化起重要作用。总之,盐生植物盐地碱蓬的耐盐性与其细胞Na~+区隔化、细胞Na~+的外排以及细胞对水分的吸收有密切关系。盐胁迫促进了盐地碱蓬幼苗液泡膜Na~+/H~+ antiporter基因的转录,酶蛋白含量的增加,进而增大了Na~+/H~+ antiporter的活性,促进了Na~+区隔化入液泡;盐胁迫促进了盐地碱蓬愈伤组织质膜H~+-ATPase基因的转录,酶蛋白含量的增加,进而增大了质膜H~+-ATPase的活性,为质膜Na~+/H~+逆向转运蛋白提供了更多的质子驱动力,促进了Na~+/H~+逆向转运蛋白的活性,从而促进了细胞质内Na~+的外排,减小了Na~+的毒害;盐胁迫促进了盐地碱蓬幼苗质膜水孔蛋白基因的转录和翻译,增大了质膜水孔蛋白的活性,增加了细胞的吸水,促进盐地碱蓬幼苗的肉质化,使其更好的适应盐渍生境。

全文目录

摘要  8-13
Abstract  13-20
第一部分文献综述  20-52
  1 Na~+内流相关的膜转运蛋白  22-25
  2 Na~+区隔化相关的膜转运蛋白  25-32
  3 Na~+外排相关的膜转运蛋白  32-45
  4 盐渍条件下水孔蛋白与植物的水分吸收  45-49
  5 实验目的和意义  49-52
第二部分材料与方法  52-68
  1 材料与方法  52-68
    1.1 实验材料  52
    1.2 实验材料的培养与处理  52-53
      1.2.1 材料的培养  52-53
      1.2.2 材料的处理  53
    1.3 实验方法  53-68
      1.3.1 生长指标测定  53-54
        1.3.1.1 盐地碱蓬幼苗鲜重、干重、有机干重、叶片肉质化程度的测定  53-54
        1.3.1.2 盐地碱蓬愈伤组织的相对生长速率(RGR)、含水量、有机干重的测定  54
      1.3.2 叶片质外体、共质体Na~+含量的测定  54-55
      1.3.3 盐地碱蓬愈伤组织 Na~+、K~+、Ca~(2+)、Cl~-含量的测定  55
      1.3.4 盐地碱蓬叶片细胞汁液Na~+、Cl~-浓度的测定  55
      1.3.5 渗透势和渗透调节能力的测定  55-56
      1.3.6 盐地碱蓬愈伤组织有机溶质的测定  56-58
        1.3.6.1 有机酸含量的测定  56
        1.3.6.2 脯氨酸含量的测定  56-57
        1.3.6.3 可溶性糖含量的测定  57-58
        1.3.6.4 游离氨基酸的测定  58
      1.3.7 盐地碱蓬叶片原生质体的分离  58-59
      1.3.8 质膜、液泡膜微囊的制备  59-60
      1.3.9 蛋白质含量的测定  60
      1.3.10 质膜水解活性的测定  60-62
        1.3.10.1 液泡膜 H~+-ATPase 水解活性、液泡膜 H~+ -pump 活性和液泡膜 Na~+/H~+ 逆向转运蛋白活性的测定  60-62
      1.3.11 SDS-PAGE 和Western blot analysis  62
      1.3.12 质子分泌实验  62-63
      1.3.13 盐地碱蓬叶片总RNA 的提取  63-65
        1.3.13.1 Trizol 试剂提取植物总RNA  63-64
        1.3.13.2 异硫氰酸胍法提取总RNA  64-65
      1.3.14 Northern 杂交分析  65-68
        1.3.14.1 在含有甲醛的凝胶上进行 RNA 电泳  65
        1.3.14.2 RNA 杂交膜的制备  65-66
        1.3.14.3 cDNA 探针的制备  66
        1.3.14.4 杂交过程  66-68
第三部分实验结果  68-91
  一、盐地碱蓬液泡膜H~+-ATPase 和Na~+/H~+ antiporter 在 Na~+区隔化中的作用  68-77
    1 NaCl 处理对盐地碱蓬幼苗生长的影响  68
    2 盐地碱蓬幼苗不同器官中 Na~+的含量和分布  68-72
    3 Na~+在盐地碱蓬幼苗地上部分质外体和共质体中的分布  72-73
    4 V-H~+-ATPase 和Na~+/H~+ antiporter 的活性分析  73-75
    5 SsNHX1 的Northern blot 分析  75-76
    6 Na~+/H~+ antiporter 的 Weston blot 分析  76-77
  二、盐地碱蓬质膜 ATPase 活性及其在耐盐性中的作用  77-87
    1 NaCl 处理对盐地碱蓬愈伤组织相对生长速率、含水量和有机干重的影响  77-79
    2 NaCl 处理对盐地碱蓬愈伤组织溶质含量的影响及各种溶质对渗透调节的相对贡献  79-81
    3 NaCl 处理对盐地碱蓬愈伤组织 Na~+/K~+、渗透势和渗透调节能力的影响  81-82
    4 NaCl 处理对盐地碱蓬愈伤组织质膜 ATPase 的影响  82-87
      4.1 质膜 ATPase 水解活性  82-83
      4.2 质膜 ATPase 质子分泌速率  83-85
      4.3 质膜 H~+-ATPase 基因表达  85-86
      4.4 质膜 H~+-ATPase 蛋白表达  86-87
  三、盐渍条件下水孔蛋白在盐地碱蓬叶片肉质化中的作用  87-91
    1 盐处理对盐地碱蓬叶片肉质化的影响  87-88
    2 NaCl 处理对盐地碱蓬原生质体水通透性的影响  88-89
    3 NaCl 处理对盐地碱蓬质膜水孔蛋白表达的影响  89-91
第四部分讨论  91-101
  一、盐地碱蓬液泡膜 H~+-ATPase 和 Na~+/H~+ antiporter 在 Na~+区隔化中的作用  91-95
  二、盐地碱蓬细胞质膜质子泵活性及其在耐盐性中的作用  95-99
  三、盐渍条件下水孔蛋白在盐地碱蓬叶片肉质化中的作用  99-101
本论文的主要创新点  101-102
进一研究打算  102-103
参考文献  103-119
致谢  119-120
博士期间发表的主要论文  120

盐地碱蓬膜相关蛋白及其在耐盐中的作用

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