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骨髓基质干细胞治疗C6脑胶质瘤的实验研究

作　者: 郑朝辉
导　师: 刘卫平
学　校: 第四军医大学
专　业: 外科学
关键词: 骨髓基质干细胞 BrdU Transwell共培养 C6胶质瘤
分类号: R739.41
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤,约占颅内原发肿瘤的40%,成侵袭性生长,不易完全切除,术后易复发,预后差。干细胞在特定环境下,可以向肿瘤或损伤区域迁移运动,干细胞的移植可靶向性的治疗疾病。骨髓基质干细胞(BMSCc)是存在于骨髓中的具有自我更新和多向分化潜能的非造血干细胞,可诱导分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、表皮细胞、心肌细胞和神经细胞等;而且其培养技术和条件相对简单,来源广、取材容易、传代稳定,避开了免疫排斥和伦理障碍,是干细胞研究中的新秀。BMSCs与其它干细胞一样可以分泌细胞营养因子和细胞活素类物质,如干细胞因子、神经营养因子、白介素及干扰素等;BMSCs的多向分化潜能可以促进病变区域的功能恢复,同时向病变部位迁移;而且有研究证实BMSCs可以进入中枢神经系统而不受到血脑屏障的影响。本研究通过其对在体内体外C6胶质瘤细胞的生长情况和治疗效果进行观察,为骨髓基质干细胞在颅内病变时行细胞的替代治疗做探索性研究。1大鼠骨髓基质干细胞的分离培养及鉴定和标记目的:通过稳定可靠的骨髓基质干细胞体外培养模型(全细胞培养法)培养扩增获得纯化的骨髓基质干细胞,为进一步的实验奠定基础。方法:无菌取SD大鼠骨髓液并移至培养瓶,加入DMED/F12+10%FBS培养液,原代静置培养48h后半量换液;以后正常换液,待细胞铺满瓶底80%左右时进行传代。第4代细胞形态较为均一,MTT法测定细胞活性和绘制生长曲线,流式细胞术检测BMSCs表面标记CD14、CD34、CD45、CD29、CD90、CD105表达率。结果:在培养初期可见大量悬浮细胞,48h后可见有散在纺锤形或梭形贴壁细胞;第4代后细胞呈形态均一的纺锤形或梭形,分布均匀。细胞生长曲线可见细胞呈一种持续的增殖状态,培养4-6天后进入对数生长期。行流式细胞技术检测细胞表面抗原标记,显示为体形均一的细胞群,CD14、CD34、CD45的表达率分别为2.4%、1.6%、2.7%,为阴性;CD29、CD90、CD105的阳性率分别为98.9%、99.5%、99.1%,为阳性。结论:通过体外骨髓的全细胞培养的方法可获得高纯度的BMSCs,并可在体外稳定培养。2体外鼠BMSCs对C6胶质瘤细胞的趋向性及抑制作用目的:探讨BMSCs在体外微环境下对C6胶质瘤细胞的趋向性,并初步研究BMSCs在体外微环境下对C6胶质瘤细胞增殖的抑制作用。方法:BMSCs与C6胶质瘤细胞以Transwell法共培养72h,对迁移的BMSCs行HE染色并对C6胶质瘤细胞行Weston法检测细胞凋亡;每12h对C6胶质瘤细胞行MTT法绘制细胞生长曲线。结果:迁移的BMScs行HE染色示Transwell培养板小室下面存在大量的迁移细胞;Weston Blot检测结果显示,与对照组比较,共培养组C6细胞的抗凋亡蛋白Bcl2表达水平明显下降,同时促凋亡蛋白Caspase3表达水平明显升高(P<0.01);MTT法绘制生长曲线示实验组较对照组的C6胶质瘤细胞生长增殖抑制(P<0.05)。结论:BMSCs在体外微环境下对C6胶质瘤细胞具有明显的趋向性,可能影响C6胶质瘤细胞生存的微环境,也可以用来作为目的基因或药物的载体;BMSCs在体外微环境下对C6胶质瘤细胞存在抑制生长的作用,流式细胞法检测比较明显,而MTT法生长曲线不明显,可能是时间段间隔较短或者细胞数量较少的原因。目的:建立C6胶质瘤模型,通过在体实验探讨BMSCs在体内环境下对C6胶质瘤趋向性及生长的抑制及其对荷瘤大鼠的机体功能和生存周期的影响,观察其治疗效果。方法:体外培养大鼠C6胶质瘤细胞,立定定向接种1.0×106个/10μC6胶质瘤细胞于SD大鼠右侧尾状核,建C6胶质瘤的SD大鼠荷瘤模型;1周后向左侧侧脑室注射BrdU标记的BMSCs;观察2个月,记录大鼠机体功能变化和生存情况,SD大鼠生存周期绘成Kaplan-Meier图,组间差异行Log-rank Test(时序检验);大鼠自然死亡后行HE染色和BrdU免疫组化染色,检测胶质瘤的情况和BMSCs对胶质瘤的趋向性。结果:接种一周后,各组大鼠精神差,活动减少,饮食减少,体重渐减,自然死亡前肢体不自主抽动,实验组各大鼠各种机体功能减退及体重减轻较对照组轻,饮食量相对大;各组成瘤率为100%;对照组各鼠在60天内均死亡,中位生存期为20.05 1.087d;治疗组中位生存期为31.55 3.092d,其中有2只长期存活>60d,具有统计学意义(P<0.05),但在早期实验组较对照组生存周期延长并不明显。HE染色结果示实验组C6胶质瘤瘤体较对照组小,而且肿瘤边缘向周围脑组织浸润较少;BrdU免疫组化染色结果示BMSCs存在于肿瘤组织及其周边,其分布呈由肿瘤边缘至中心BMScs越来越少。结论:接种106个C6胶质瘤细胞于SD大鼠右侧尾状核,可以构建特性稳定的SD大鼠C6胶质瘤模型,且特征接近于人脑恶性胶质瘤,实验重复性高,为后续实验的进行打下了良好的基础;侧脑室移植BMSCs后,BMSCs存在向肿瘤组织迁移的特性,可以改善荷瘤大鼠的精神状态、饮食、体重及运动等功能,明显延长其晚期生存周期。3体内鼠BMSCs对C6胶质瘤的治疗作用

全文目录

缩略语表  4-6
中文摘要  6-9
ABSTRACT  9-13
前言  13-14
文献回顾  14-23
  1 脑胶质瘤的概述  14-17
  2 骨髓基质干细胞  17-23
实验一大鼠骨髓基质干细胞的分离培养及鉴定  23-30
  1 材料  23-25
    1.1 主要仪器与试剂  23-24
    1.2 实验动物  24
    1.3 主要工作液及配制  24-25
  2 方法  25-26
    2.1 BMSCs 分离培养（全骨髓培养法）  25
    2.2 细胞形态学观察  25
    2.3 MTT 实验  25-26
    2.4 流式细胞技术鉴定BMSCs  26
  3 结果  26-28
    3.1 细胞形态学观察  26
    3.2 细胞生长曲线  26-27
    3.3 流式细胞技术鉴定BMSCs  27-28
  4 讨论  28-30
实验二体外鼠BMSCS 对C6 胶质瘤细胞的趋向性及抑制作用  30-38
  1 材料  30-31
    1.1 主要仪器和试剂  30-31
    1.2 细胞系  31
  2 方法  31-34
    2.1 Transwell 小室的包被  31
    2.2 BMSCs 和C6 细胞的单细胞悬液制备  31-32
    2.3 BMSCs 与C6 胶质瘤细胞共培养  32
    2.4 HE 染色观察BMSCs 的迁移性和MTT 检测C6 活性  32
    2.5 蛋白免疫印记分析C6 细胞的凋亡  32-34
    2.6 统计学分析  34
  3 结果  34-36
    3.1 BMSCs 向C6 胶质瘤的迁移性  34-35
    3.2 MTT 检测C6 活性和生长曲线  35
    3.3 蛋白免疫印记分析C6 细胞的凋亡  35-36
  4 讨论  36-38
实验三体内鼠BMSCS 对C6 胶质瘤的治疗作用  38-47
  1 材料  38-39
    1.1 主要仪器和试剂  38-39
    1.2 主要工作液的配制  39
    1.3 实验动物和细胞  39
  2 方法  39-43
    2.1 建立C6 胶质瘤大鼠模型  39-41
    2.2 BMSCs 的移植  41
    2.3 疗效观察  41
    2.4 灌注取材  41
    2.5 免疫组化  41-43
  3 结果  43-44
    3.1 一般观察  43
    3.2 HE 染色  43-44
    3.3 免疫组化结果  44
    3.4 生存周期  44
  4 讨论  44-47
小结  47-48
参考文献  48-58
附录  58-61
个人简历和研究成果  61-62
致谢  62

骨髓基质干细胞治疗C6脑胶质瘤的实验研究

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