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基于邻近表面杂交分析的电化学生物传感技术用于蛋白和核酸的检测

作　者: 张艳丽
导　师: 蒋健晖；俞汝勤
学　校: 湖南大学
专　业: 分析化学
关键词: 电化学传感器 适体传感器 DNA传感器 免疫传感器 邻近表面杂交分析 蛋白质 分子信标 金增强
分类号: Q52-3
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


随着人类基因组计划的完成和功能蛋白质组学、基因组学的研究进展,发展高灵敏的方法用于蛋白质和核酸的快速分子监测就成为后基因时代的主要研究领域。电化学传感器由于其仪器简单、灵敏、选择性高等优点吸引了许多研究人员的注意,并成为研究的热点。基于当前对蛋白质和核酸的检测技术提出的高灵敏、高选择、高特异性和简便、高通量的要求,本论文发展了一系列新的电化学生物传感方法用于检测蛋白质和核酸,为蛋白质和核酸分子检测提供高性能的技术平台。并通过对实际样品的分析以及与经典检测方法的结果对照,初步验证了这些技术的实用性。(1)在第2章,我们利用核酸适体这一种通过体外组合化学筛选技术所得到的对目标蛋白分子具有高亲和力的寡核苷酸探针,基于一对亲合性核酸适体探针同时识别目标分子而空间邻近导致与某一互补序列杂交使稳定性提高这一邻近效应,提出了一种高灵敏的检测模型分析物血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)的表面邻近杂交分析电化学适体传感方法。该法首先在金电极表面利用巯基自组装技术固定了巯基修饰的短链寡核苷酸探针,设计了一个尾端延伸序列与短链寡核苷酸探针互补的PDGF-B核酸适体探针。该适体探针尾端修饰电活性基团二茂铁,且单个尾端序列与表面固定的短链寡核苷酸探针的熔链温度较低。利用该核酸适体探针可成对地与二聚体目标蛋白PDGF-BB同时结合,由于邻近效应促进两尾端序列同时与电极表面固定的两条短链寡核苷酸杂交,使得适体探针末端二茂铁标记与电极充分接近而发生高效电子传递,产生了显著的氧化还原电流。我们运用循环伏安法、差示脉冲伏安法、阻抗谱对该法进行了系统的表征,证实了该传感机理。结果表明,该法可实现PDGF-BB的高特异性地检测,响应动态范围可从1.0 pg/mL到20 ng/mL,检测限可达1.0 pg/mL。(2)鉴于上述邻近表面杂交分析技术中涉及一对邻近探针同时与第三探针的杂交,我们在实验中发现这种邻近杂交对热稳定性的改善仍然不是充分大,不利于分析灵敏度的提高与探针的设计。第3章中,我们在此实验发现的基础上,基于一对不同的核酸适体探针与目标蛋白同时结合而彼此邻近的效应,进一步发展了相关模型蛋白PDGF-BB检测的电化学适体表面邻近杂交分析传感技术。该法首先在金电极表面利用巯基自组装技术固定了巯基修饰的短链寡核苷酸探针,设计了一个尾端延伸序列与短链寡核苷酸探针5’半片段互补的PDGF-B核酸适体探针,该适体探针尾端修饰电活性基团二茂铁,且单个尾端序列与表面固定的短链寡核苷酸探针的熔链温度较低。同样地,设计了另一个尾端延伸序列与短链寡核苷酸探针3’半片段互补且熔链温度较低的PDGF-B核酸适体探针,其识别位点与第一适体探针不同,并且尾端序列下游具有与第一核酸适体探针尾端上游有较短的互补序列,这一短互补序列熔链温度也较低。两条不同的核酸适体探针可同时识别PDGF不同位点由于邻近而相互杂交,杂交体两尾端序列可与电极表面固定的巯基短链寡核苷酸杂交,并使末端二茂铁标记与电极充分接近,产生了显著的氧化还原电流。结果表明,该方法检测范围更宽,从0.1 pg/mL到50 ng/mL,检测限降低了一个数量级,为0.1 pg/mL。(3)第4章中,鉴于表面邻近杂交分析的高特异性与高灵敏度,我们发展了目标核酸分子检测的表面邻近杂交电化学传感技术,进一步拓展了表面邻近杂交分析的应用范围。与蛋白分子表面邻近杂交不同的是,核酸分子邻近杂交可利用待测核酸序列本身构成一对邻近探针。为此,我们设计了一个寡核苷酸检测探针,其3’末端修饰二茂铁,5’半片段与目标核酸分子互补且具有较高熔链温度,若目标核酸分子存在,检测探针与其杂交形成稳定的杂交体,杂交体一侧检测探针与目标核酸分子其余序列邻近,促进与电极表面固定的巯基短链寡核苷酸杂交,并使末端二茂铁标记与电极充分接近,产生了显著的氧化还原电流。与传统夹心式杂交分析相比,该法保证了末端二茂铁标记与电极充分接近,电子转移效率提高,可望显著改善灵敏度。且由于邻近分析使用了更短的互补序列,可有效提高其选择性。结果表明,该方法检测的线性范围宽,为1 fM到1 nM,而且能够成功的识别不同碱基数错配的序列。(4)第5章中,鉴于目前核酸适体较为有限不能满足大量蛋白检测的需要,我们发展了目标蛋白分子检测的表面邻近杂交电化学免疫传感技术,用一对核酸探针修饰的抗体代替核酸适体探针,将表面邻近杂交分析拓展运用于蛋白质的免疫检测,为建立蛋白分子检测的通用技术平台提供技术依据。以前列腺特异性抗原PSA为模型分析物,提出了基于表面邻近杂交分析的高灵敏PSA的电化学免疫传感技术。此技术原理与第3章的电化学适体传感器类似,利用一对识别PSA不同抗原决定簇的单克隆抗体,设计了与这一对单克隆抗体共价交联的两个寡核苷酸探针,一个尾端延伸序列与巯基修饰短链寡核苷酸探针5’半片段互补且熔链温度较低,该探针3’端修饰二茂铁;另一个尾端延伸序列与巯基修饰短链寡核苷酸探针3’半片段互补且熔链温度较低,而且,第二探针尾端序列下游与与第一探针尾端上游有较短的互补序列,这一短互补序列熔链温度也较低。抗体对与抗原同时结合后,两核酸探针由于邻近而相互杂交,杂交体两尾端序列可与电极表面固定的巯基短链寡核苷酸杂交,并使末端二茂铁标记与电极充分接近,产生了显著的氧化还原电流。结果表明,该方法检测动态范围为25 pg到1 ng,检测下限为25 pg,且该免疫传感器可再生使用。(5)第6章中,提出了一种基于分子信标变构控制的电化学通道法检测目标核酸分子杂交反应的电化学DNA传感方法。该方法设计运用了一种发夹结构核酸探针分子,其一端标记有生物素作为阻塞源,另一端标记氨基并通过二硫杂环化合物共价固定于金电极表面,电极用巯基十一酸自组装膜封闭。由于发夹探针茎部核酸双链螺旋体空间位阻较大,生物素阻塞元与巯基十一酸疏水烷基链作用进一步提高空间位阻,不利于电活性分子表面扩散。当探针与目标核酸分子杂交时,探针发夹构象改变,茎部双链结构改变为柔性单链结构,阻塞物离开电极表面,在巯基十一酸自组装膜内形成电化学针孔通道,使得电活性分子可进行表面扩散,产生电化学氧化还原电流。使用该方法对包含第142位密码子的α地中海贫血基因片断进行了分析。浓度检测动态线性范围为2.8×10-18 - 8.7×10-8 M,检测限可达1.1×10-19 M。该方法灵敏、特异性好、无需标记、可再生,可以很好地用于单碱基错配的区分。(6)第7章中,建立了一种基于纳米金标记及金增强表面吸附伏安分析的新型电化学免疫传感技术。该方法以人免疫球蛋白G(h IgG)为模型分析物,将羊抗人免疫球蛋白G抗体固定于玻碳电极表面构成免疫传感器界面。固定化抗体与分析目标物h IgG发生免疫反应而将h IgG捕获,利用夹心法将纳米金标记的h IgG抗体结合于电极表面。通过纳米金自催化还原可在电极表面形成大粒径纳米金颗粒,增加电极表观面积与纳米金粒子与电极界面的电荷转移效率。利用电活性探针在金表面的自组装吸附,用差示脉冲伏安法对电极表面吸附量进行检测,可实现目标蛋白的高灵敏定量免疫分析。

全文目录


摘要  5-8
Abstract  8-17
第1章 绪论  17-43
  1.1 生物传感器简介  17-22
    1.1.1 生物传感器的工作原理和基本结构  17-18
    1.1.2 生物传感器的分类及发展历史  18
    1.1.3 生物传感器的特点  18-19
    1.1.4 生物传感器的应用  19-20
    1.1.5 生物传感器的发展趋势  20-22
  1.2 电化学生物传感器  22-26
    1.2.1 电化学生物传感器的原理  22-23
    1.2.2 电化学生物传感器的分类  23
    1.2.3 基底电极的选择  23-24
    1.2.4 检测技术  24-26
  1.3 电化学DNA 传感器  26-31
    1.3.1 电化学DNA 传感器原理  27
    1.3.2 电化学DNA 传感器的种类  27-29
    1.3.3 DNA 探针及其固定方法  29-31
    1.3.4 前景与展望  31
  1.4 电化学适体传感器  31-37
    1.4.1 SELEX 技术  32
    1.4.2 适体与配体的相互作用  32-33
    1.4.3 适体传感器的特点  33-34
    1.4.4 电化学适体生物传感器  34-37
    1.4.5 前景与展望  37
  1.5 电化学免疫传感器  37-41
    1.5.1 免疫分析的简介  37
    1.5.2 免疫分析的分类  37-38
    1.5.3 免疫分析的检测原理  38
    1.5.4 免疫传感器中抗原（抗体）的固定方法  38-39
    1.5.5 电化学免疫传感器  39-40
    1.5.6 前景与展望  40-41
  1.6 本文构思  41-43
第2章 基于邻近表面杂交分析的电化学适体传感器用于蛋白分子检测  43-56
  2.1 前言  43-45
  2.2 实验部分  45-47
    2.2.1 试剂和仪器  45-46
    2.2.2 适体探针的设计及杂交温度  46
    2.2.3 二茂铁标记NH2–修饰的寡核苷酸的标记  46-47
    2.2.4 金电极的处理和DNA 的固定  47
    2.2.5 PDGF-BB 的电化学检测  47
  2.3 结果与讨论  47-55
    2.3.1 传感器的电化学响应  47-48
    2.3.2 阻抗谱法的表征  48-49
    2.3.3 电极表面巯基DNA 的固定密度  49-50
    2.3.4 二茂铁标记的核酸适体的表面覆盖率  50
    2.3.5 不同扫速下的二茂铁峰电流  50-51
    2.3.6 盐离子浓度对反应的影响  51-52
    2.3.7 培育时间和温度的影响  52-54
    2.3.8 PDGF-BB 浓度的测定  54
    2.3.9 干扰实验  54-55
    2.3.10 传感器的再生  55
  2.4 小结  55-56
第3章 基于邻近双序列表面杂交分析电化学适体传感器用于蛋白分子检测  56-67
  3.1 前言  56-58
  3.2 实验部分  58-60
    3.2.1 试剂和仪器  58
    3.2.2 适体探针的设计  58-59
    3.2.3 二茂铁标记NH2–修饰的寡核苷酸的标记  59-60
    3.2.4 金电极的处理和DNA 的固定  60
    3.2.5 PDGF-BB 的电化学检测  60
  3.3 结果与讨论  60-66
    3.3.1 传感器的电化学响应  60
    3.3.2 交流阻抗谱法的对不同修饰界面的表征  60-62
    3.3.3 电极表面巯基DNA 的固定密度  62
    3.3.4 二茂铁标记的核酸适体的表面覆盖率  62-63
    3.3.5 不同扫速下的电化学行为  63
    3.3.6 PDGF-BB 浓度的测定  63-64
    3.3.7 干扰实验  64-65
    3.3.8 传感器的再生  65
    3.3.9 实际样品的检测  65-66
  3.4 小结  66-67
第4章 基于邻近表面杂交分析电化学DNA 传感技术用于核酸分子检测  67-78
  4.1 前言  67-68
  4.2 实验部分  68-69
    4.2.1 试剂和仪器  68-69
    4.2.2 二茂铁标记NH2–修饰的寡核苷酸  69
    4.2.3 金电极的处理和DNA 的固定  69
    4.2.4 目标DNA 的电化学检测  69
  4.3 结果与讨论  69-77
    4.3.1 核酸链的设计和杂交温度  69-70
    4.3.2 传感器的电化学响应  70-71
    4.3.3 阻抗谱法的表征  71
    4.3.4 电极表面巯基DNA 的固定密度  71
    4.3.5 二茂铁标记的核酸适体的表面覆盖率  71-72
    4.3.6 不同扫速下的二茂铁峰电流  72
    4.3.7 盐离子浓度对反应的影响  72-74
    4.3.8 培育温度对反应的影响  74
    4.3.9 界面电场对DNA 杂交的影响  74-75
    4.3.10 目标DNA 浓度的测定  75-76
    4.3.11 特异性识别碱基错配实验  76
    4.3.12 传感器的再生  76-77
  4.4 小结  77-78
第5章 基于邻近表面杂交分析的电化学免疫传感器用于蛋白分子检测  78-87
  5.1 前言  78-80
  5.2 实验部分  80-82
    5.2.1 试剂和仪器  80-81
    5.2.2 与抗体相连的核酸探针的设计  81
    5.2.3 二茂铁标记NH_2–修饰的寡核苷酸的标记  81
    5.2.4 抗体和寡核苷酸链的共价结合  81
    5.2.5 金电极的处理和DNA 的固定  81
    5.2.6 PSA 的电化学检测  81-82
  5.3 结果与讨论  82-85
    5.3.1 传感器的电化学响应  82-83
    5.3.2 交流阻抗谱法的表征  83-84
    5.3.3 电极表面巯基DNA 的固定密度  84
    5.3.4 二茂铁标记的核酸适体的表面覆盖率  84
    5.3.5 不同扫速下的电化学行为  84
    5.3.6 PSA 浓度的测定  84-85
  5.4 小结  85-87
第6章 分子信标变构控制的电化学DNA 生物传感器技术用于核酸分子检测  87-100
  6.1 前言  87-89
  6.2 实验部分  89-90
    6.2.1 试剂和仪器  89-90
    6.2.2 电极的预处理和分子信标的固定  90
    6.2.3 目标链的检测  90
  6.3 结果与讨论  90-98
    6.3.1 电极表面分子信标的固定密度  90-91
    6.3.2 分子信标环状部分与目标链杂交双链的熔链温度的考察  91-92
    6.3.3 分子信标稳定性的考察  92-93
    6.3.4 传感器的电化学响应特性  93-95
    6.3.5 在Fe(CN)_6~(3-/4-)溶液中的交流阻抗特性  95-97
    6.3.6 碱基不匹配目标链的区分  97
    6.3.7 目标链的检测  97-98
    6.3.8 传感器的再生  98
  6.4 小结  98-100
第7章 基于纳米金增强吸附伏安分析的电化学免疫传感技术用于蛋白分子检测  100-108
  7.1 前言  100-102
  7.2 实验部分  102-103
    7.2.1 试剂和仪器  102
    7.2.2 胶体金的制备  102
    7.2.3 纳米金标记羊抗人免疫球蛋白G  102
    7.2.4 碳糊电极的制备  102-103
    7.2.5 ITO 电极的制备  103
    7.2.6 测定过程  103
  7.3 结果与讨论  103-107
    7.3.1 传感界面的电化学行为  103-104
    7.3.2 金增强时间的优化  104-105
    7.3.3 金染界面的吸收光谱性质  105
    7.3.4 金染界面的电化学性质  105-107
    7.3.5 工作曲线  107
  7.4 小结  107-108
结论  108-110
参考文献  110-135
附录A 攻读学位期间发表的学术论文目录  135-136
致谢  136

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中图分类: > 生物科学 > 生物化学 > 核酸
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