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汞胁迫下水稻根蛋白质组学及抗性相关基因功能分析

作　者: 王飞娟
导　师: 朱诚
学　校: 浙江大学
专　业: 植物学
关键词: 蛋白质组学双向电泳 Hg2+胁迫水稻根异源表达
分类号: S511
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

Hg是植物的非必需元素,是一种对生态环境和人类健康等有着巨大危害的环境污染物质。水稻(Oryza sativa L.)不仅是世界上最重要的粮食作物,也是植物研究中的模式植物。水稻在感受各种环境因子的信号后,基因表达便会发生变化,从而引起大量的蛋白质在种类和表达量上的变化以适应不同的环境。随着蛋白质组学在功能基因组时代发挥越来越重要的作用,水稻蛋白质组学的研究逐渐掀起热潮并不断完善,已经取得了很大发展。本研究以六叶期的汞耐性水稻突变体和中花11野生型水稻为材料,采用溶液培养的方法进行了用50μM HgCl2处理水稻根Oh和3h后的比较蛋白质组学研究,并通过功能基因在酵母中的异源表达对水稻中与Hg2+胁迫相关的蛋白(或基因)进行了功能的初步探讨,确定了它们与Hg2+耐性的相关性。主要研究结果如下：1.以高通量的双向电泳系统为技术平台,通过改进和优化水稻根总蛋白的提取方法、等电聚焦和SDS-PAGE条件,得到了水稻根总蛋白的高分辩率和高重复性的双向电泳图谱。2.汞耐性水稻突变体和中花11野生型在50μM HgCl2分别处理0h和3h的水稻根提取总蛋白后进行双向电泳分离,发现有29个差异蛋白点。质谱鉴定为27种蛋白,按功能可分为7大类：氧化还原平衡、信号转导、胁迫响应、代谢水平、保持细胞骨架、调节基因表达水平和未知功能蛋白。qRT-PCR实验表明大部分蛋白在基因表达水平与蛋白质表达水平并不相关。3.利用RT-PCR技术获得了水稻翻译调控肿瘤蛋白(OsTCTP, Translationally-controlled tumor protein)、水稻丝裂原活化蛋白激酶(OsMAPK, Mitogen-activated protein kinase 2)和水稻突触小泡相关蛋白(OsKNOLLE, Syntaxin-related protein KNOLLE)基因的全长序列,通过在酵母中的异源表达分析,发现过表达这三个蛋白的酵母菌株比转有空载体的酵母菌株在Hg2+胁迫下具有更好的生活力,说明它们与Hg2+耐性存在一定的相关性。同时我们也研究了这三个蛋白与其它胁迫的关系,发现OsTCTP蛋白与Cu2+耐性存在密切关系；OsKNOLLE蛋白与盐,Cu2+,H202,Cd2+胁迫相关,其中在Cd2+胁迫下作用更明显；OsMAPK蛋白则仅与Hg2+耐性存在一定的相关性。本研究首次利用突变体的差异蛋白质组分析了水稻根在Hg2+胁迫下的蛋白质表达变化,并首次确定了水稻TCTP蛋白和KNOLLE蛋白与Hg2+耐性相关。本实验的开展将有助于找到Hg2+耐性相关的基因或蛋白,有助于阐明植物对Hg2+的耐性机制,同时也有助于在生产上培育出具有汞抗性的水稻品种,或通过转基因技术改良其他作物的汞抗性,本项研究对我国粮食的安全、生态环境的保护及农业的可持续发展具有非常重要的意义。

全文目录

目录  6-8
摘要  8-10
Abstract  10-12
第一章文献综述  12-29
  第一节重金属Hg的毒害  12-16
    1 重金属Hg污染现状和来源  12
    2 Hg对植物和人类的伤害作用  12-15
    3 植物抗(耐)Hg毒害的主要机制  15-16
  第二节蛋白质组学研究  16-27
    1 蛋白质组学的研究技术  17-25
    2 水稻蛋白质组学在重金属方面的研究现状  25-27
    3 突变体的水稻蛋白质组研究  27
  第三节本项目研究的意义  27-29
第二章汞胁迫下水稻根总蛋白高分辨率双向电泳体系建立  29-41
  第一节材料和方法  29-37
    1 试验材料与水稻培养方法  29
    2 水稻根总蛋白提取和定量  29-30
    3 双向电泳和图像分析  30-35
    4 实验设备和试剂  35-37
  第二节结果与分析  37-38
  第三节讨论  38-41
第三章水稻根响应汞胁迫的蛋白质组研究  41-62
  第一节材料与方法  41-45
    1 试验材料和汞胁迫处理  41-42
    2 蛋白提取和定量  42
    3 双向电泳  42
    4 染色  42
    5 胶的扫描和图像分析  42
    6 差异蛋白点的胶内酶解  42-43
    7 差异蛋白点的质谱分析及数据库检索  43-44
    8 差异蛋白点的荧光定量PCR分析  44-45
  第二节结果与分析  45-53
    1 汞胁迫下水稻根总蛋白的双向电泳结果分析  45-47
    2 差异表达蛋白点的质谱鉴定  47-51
    3 差异表达蛋白点在基因表达水平的验证  51-53
  第三节讨论  53-61
    1 参与氧化还原平衡的蛋白  53-54
    2 参与信号转导的蛋白  54-56
    3 胁迫响应蛋白  56-57
    4 参与维持细胞结构  57-58
    5 代谢水平蛋白  58-60
    6 调节蛋白  60-61
  第四节本章小结  61-62
第四章 OsTCTP、OsMAPK和OsKNOLLE在酵母中异源表达的功能分析  62-81
  第一节材料与方法  62-70
    1 实验材料  62-63
    2 主要试剂及工具酶  63
    3 OsTCTP、OsMAPK和OsKNOLLE蛋白的结构序列分析  63
    4 OsTCTP、OsMAPK和OsKNOLLE基因的克隆  63-64
    5 OsTCTP、OsMAPK和OsKNOLLE基因的鉴定及表达载体构建  64-66
    6 酵母转化及重组子筛选  66-67
    7 OsTCTP、OsMAPK、OsKNOLLE蛋白在酿酒酵母中的功能分析及蛋白质表达水平验证  67-70
  第二节结果与讨论  70-79
    1 OsTCTP、OsMAPK和OsKNOLLE蛋白的序列分析  70-73
    2 OsTCTP、OsMAPK和OsKNOLLE基因的克隆及酵母表达载体的构建  73-74
    3 酵母重组子的耐Hg~(2+)性检测  74-79
  第三节本章小结  79-81
全文结论与展望  81-84
  1 全文结论  81-82
  2 创新之处  82-83
  3 研究展望  83-84
参考文献  84-100
致谢  100-102
发表文章和申请发明专利目录  102-103
  发表文章  102
  申请发明专利  102-103

汞胁迫下水稻根蛋白质组学及抗性相关基因功能分析

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